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Tumeur Cellule tumorale Sang/Moelle ADNARNPROTEINE Temps Marqueur Diagnostic Pronostic Réponse traitement Suivi Rechute.

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1 tumeur Cellule tumorale Sang/Moelle ADNARNPROTEINE Temps Marqueur Diagnostic Pronostic Réponse traitement Suivi Rechute

2 APL: Différenciation in vitro Cytologie Test NBT Culture des blastes leucémiques au diagnostic pendant 3-6 jours avec ATRA 0.1µM Bon RépondeurMauvais Répondeur

3 Diff<50% Diff > 50% P= 0.10 APL 93: Différenciation in vitro facteur de pronostic indépendant N= 77 Event-free survival Relapse-free survival Overall Survival

4 Diagnostic Maladie Résiduelle Rechute PCR __ + Applications de la PCR

5 Translocations des APL PML-RAR PLZF-RAR NuMA-RAR NPM-RAR STAT5b-RAR t(15;17) insertions t(11;17) (q23;q21) t(11;17) (q13;q21) t(5;17) der(17) > 95% 1% 1 cas < 1% 1 cas RT-PCR ?

6 Exons34567a34 Bcr3Bcr1Bcr2 PML chromosome 15 RAR chromosome Translocations t(15;17) Bcr1 : 60% Bcr2 : 10% Bcr3 : 30% RAR -PML exprimé chez seulement 75% des patients

7 Protocole de RT-PCR Nichée bp Bcr3 bcr2 bcr1 MW bp bcr3 bcr2 bcr1 MW PML RAR exon 3bcr exon 3 O7 O8 RAR PML R5M7 RAR PML Points de Cassure t(15,17) PCR N°1 PCR N°2 Sensibilité: à Diagnostic et MRDTypage O1 M7 RAR PML

8 p= ,1,2,3,4,5,6,7,8, months bcr2, bcr3 bcr1 Event-free survival p= ,1,2,3,4,5,6,7,8, months bcr2, bcr3 bcr1 Time to relapse after remission Pronostic selon le typage Bcr p= ,1,2,3,4,5,6,7,8, months bcr2, bcr3 bcr1 Overall survival N= 110

9 RT-PCR standard après le diagnostic (APL93) Nombre de prélèvements% de prélèvements mois après diagnostic N = Positif (%)Négatif (%) Bcr1 Bcr mois après diagnostic N = Positif (%)Négatif (%) Bcr1 Bcr2+3 Nombre de prélèvements% de prélèvements P= PositifNégatif total Bcr1 Bcr PositifNégatif total Bcr1 Bcr2+3

10 <50%>50% PCR positive PCR négative 0% 20% 40% 60% 80% <50%>50% PCR positive PCR négative PCR standard après mois (APL93) et Différenciation in vitro au diagnostic % de cellules différenciées à J3 de culture N= 37 Nombre de Patients% de Patients P= 0.038

11 PCR Positive PCR Négative rechute + rechute PositifNégatif rechute + (%) rechute - (%) PCR standard après mois (APL93) et Risque de Rechute Nombre de Patients% de Patients N= 84 P= Valeur Prédictive Négative= 82.5 %

12 Approches par RT-PCR standard Sensibilité importante (10 -6 ) - 50% des patients positifs après consolidation - 80% des patients négatifs post-conso ne vont pas rechuter - incapacité à prédire le pronostic des patients encore positifs - positivité de patients en rémission à long terme Sensibilité médiocre (10 -4 ) - < 10% des patients sont positifs après consolidation : mauvais pronostic - incapacité à prédire le pronostic des patients négatifs: 30% des rechutes sont précédées d une PCR négative - forte probabilité (70%) de rechute des patients se repositivant - essai de traitement de la rechute moléculaire : allo BMT

13 RT-PCR Quantitative en temps réel

14 PCR quantitative en temps réel Idée: suivre l apparition des produits de PCR au fur et à mesure de leur formation et non plus en point final But: détecter le point de démarrage de la partie exponentielle de la réaction qui est proportionnelle à la quantité initiale de matériel Moyen: générer un signal fluorescent proportionnel à la quantité de matériel et suivre la fluorescence au cours de la réaction

15 Agents Intercalants

16 Amorce sens Amorce antisens RQ Q 3 R Q Q 3 Polymérisation Déplacement du brin Clivage Fin de la polymérisation RR R = Reporter Q = Quencher Sonde Taqman

17 Source laser Spectrographe Lentille Miroir dichroïque Fibres optiques Plaque 96 puits Multiplexer REPRESENTATION DU SYSTEME DE DETECTION DE LA FLUORESCENCE (Abi Prism 7700)

18 Accumulation des produits de PCR Seuil Cycle Seuil = Ct

19 Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10 Ct des différentes dilutions

20 Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10

21 Temps Marqueur Diagnostic Pronostic Réponse traitement Suivi Rechutes Diagnostic Maladie Résiduelle Rechute PCR Standard __ + PCR Quantitative

22 Sonde Protocole de RT-PCR Quantitative en temps réel RAR PML Sonde Bcr1 Bcr2 Sonde 123 RAR PML Bcr3 Normalisation par rapport à un gène de ménage: Housekeeping gene

23 RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003 Comparaison Moelle - Sang

24 RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003 Risque de rechute et DFS selon cutoff de positivité après consolidation

25 Indétectable Diagnostic1 mois RQ-PCR: nombre de copies au diagnostic et après 1 mois N= 25 Nombre de copies au diagnostic

26 1 mois après le Diagnostic N= <50%>50% Positif Négatif Nombre de patients % de cellules différenciées à J3 de culture p=0.022 RQ-PCR: Positivité et Différenciation au diagnostic Corrélation entre différenciation au diagnostic et positivité en RQ-PCR à 1 mois

27 Indétectable Mois Rechute Suivi par RQ-PCR: Exemple de résultat Nombre de Copies Normalisé

28 Conclusion Méthode de choix: RQ-PCR - quantifier la qualité des échantillons - suivi cinétique de la réponse au traitement - suivi cinétique d une re-positivation - évaluer des seuils Objectifs : - établir un schéma précis des temps de prélèvements - Sang ou moelle ? - établir des seuils prédictifs de l évolution des patients * seuil après traitement : Induction? Consolidation? * seuil de re-positivation * seuil de positivité d un échantillon pour autogreffe - standardisation Question : traitement de la rechute moléculaire? Arsenic?

29 Induction Consolidation Entretien Rémission Début Fin Fin 1/6 mois 1/6 mois MOELLE RQ-PCR Entretien Rémission 1/3 mois 1/6 mois SANG RQ-PCR Protocole de prélèvements dans la leucémie aiguë à promyélocytes

30 Références Bibliographiques - David Grimwade The significance of minimal residual disisease in patients with t(15;17) Best Practice and research Clinical Haematology Vol15, n°1, p , Grimwade D, Lo Coco F Acute promyelocytic leukemia: a model for the role of molecular diagnosis and residual disease monitoring in directing treatment approach in acute myeloid leukemia. Leukemia Oct;16(10): Gallagher RE et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of PML-RARa mRNA in acute promyelocytic leukemia: assessment of prognostic significance in adult patients from intergroup protocol 0129 Blood Vol 101, n°7 p , 2003


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