Sang/Moelle tumeur Cellule tumorale Marqueur Temps ADN ARN PROTEINE

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1 Sang/Moelle tumeur Cellule tumorale Marqueur Temps ADN ARN PROTEINE
Diagnostic Pronostic Réponse traitement Rechute Suivi Temps

2 APL: Différenciation in vitro
Culture des blastes leucémiques au diagnostic pendant 3-6 jours avec ATRA 0.1µM Mauvais Répondeur Bon Répondeur Cytologie Test NBT

3 APL 93: Différenciation in vitro facteur de pronostic indépendant
Relapse-free survival Event-free survival days P(event free) 500 1000 1500 2000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Diff<50% Diff > 50% P= 0.01 days P(relapse free) 500 1000 1500 2000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Diff<50% Diff > 50% P= 0.04 Overall Survival days P(survival) 500 1000 1500 2000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Diff > 50% Diff<50% P= 0.10

4 Applications de la PCR +++ + Diagnostic Rechute Maladie Résiduelle _

5 Translocations des APL
PML-RARa PLZF-RARa NuMA-RARa NPM-RARa STAT5b-RARa t(15;17) insertions t(11;17) (q23;q21) t(11;17) (q13;q21) t(5;17) der(17) > 95% 1% 1 cas < 1% RT-PCR ?

6 Translocations t(15;17) Bcr3 Bcr2 Bcr1 Exons 3 4 5 6 7a 3 4 PML
chromosome 15 RARa chromosome 17 Bcr1 : 60% Bcr2 : 10% Bcr3 : 30% RARa-PML exprimé chez seulement 75% des patients

7 Protocole de RT-PCR Nichée
exon 3 bcr 3 bcr 2 bcr 1 exon 3 Points de Cassure t(15,17) PML RAR Diagnostic et MRD Typage O1 M7 RAR PML PCR N°1 O7 O8 RAR PML R5 M7 RAR PML PCR N°2 bcr bcr2 bcr1 MW bp 2072 Bcr3 bcr2 bcr1 MW bp 600 2072 600 100 100 Sensibilité: 10-5 à 10-6

8 Pronostic selon le typage Bcr
Event-free survival Time to relapse after remission ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 bcr2, bcr3 bcr1 p= 0.05 bcr2, bcr3 bcr1 p= 0.06 months months Overall survival ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1 N= 110 bcr2, bcr3 bcr1 p= 0.05 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 months

9 RT-PCR standard après le diagnostic (APL93)
4 - 6 mois après diagnostic N = 84 Nombre de prélèvements % de prélèvements 50 10 20 30 40 50 60 70 Positif (%) Négatif (%) Bcr1 Bcr2+3 total 40 Bcr1 30 P= 0.61 Bcr2+3 20 10 Positif Négatif 12 mois après diagnostic N = 65 Nombre de prélèvements % de prélèvements 10 20 30 40 50 Positif Négatif 10 20 30 40 50 Positif (%) Négatif (%) Bcr1 Bcr2+3 total Bcr1 Bcr2+3

10 PCR standard après 4 - 6 mois (APL93)
et Différenciation in vitro au diagnostic N= 37 Nombre de Patients % de Patients 5 10 15 20 <50% >50% PCR positive PCR négative 0% 20% 40% 60% 80% <50% >50% PCR positive PCR négative P= 0.038 % de cellules différenciées à J3 de culture % de cellules différenciées à J3 de culture

11 PCR standard après 4 - 6 mois (APL93)
et Risque de Rechute N= 84 Nombre de Patients % de Patients 5 10 15 20 25 30 35 PCR Positive Négative rechute + rechute - 20 40 60 80 100 Positif Négatif rechute + (%) rechute - (%) P= 0.010 Valeur Prédictive Négative= 82.5 %

12 Approches par RT-PCR standard
Sensibilité importante (10-6) - 50% des patients positifs après consolidation - 80% des patients négatifs post-conso ne vont pas rechuter - incapacité à prédire le pronostic des patients encore positifs - positivité de patients en rémission à long terme Sensibilité médiocre (10-4) - < 10% des patients sont positifs après consolidation : mauvais pronostic - incapacité à prédire le pronostic des patients négatifs: 30% des rechutes sont précédées d ’une PCR négative - forte probabilité (70%) de rechute des patients se repositivant - essai de traitement de la rechute moléculaire : allo BMT

13 RT-PCR Quantitative en temps réel

14 PCR quantitative en temps réel
Idée: suivre l ’apparition des produits de PCR au fur et à mesure de leur formation et non plus en point final But: détecter le point de démarrage de la partie exponentielle de la réaction qui est proportionnelle à la quantité initiale de matériel Moyen: générer un signal fluorescent proportionnel à la quantité de matériel et suivre la fluorescence au cours de la réaction

15 Agents Intercalants

16 Sonde Taqman Polymérisation R = Reporter Q = Quencher
Amorce sens R Q 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ Amorce antisens Déplacement du brin R Q 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ R Clivage Q 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ R Fin de la polymérisation Q 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’

17 REPRESENTATION DU SYSTEME DE DETECTION DE LA FLUORESCENCE (Abi Prism 7700)
Source laser Spectrographe Lentille Miroir dichroïque Fibres optiques Plaque 96 puits Multiplexer

18 Accumulation des produits de PCR
Seuil Cycle Seuil = Ct

19 Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10
Ct des différentes dilutions

20 Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10

21 Marqueur Temps +++ + + +++ Diagnostic Rechute Maladie Résiduelle PCR
Standard _ _ +++ + + +++ Temps Marqueur Diagnostic Pronostic Réponse traitement Suivi Rechutes PCR Quantitative

22 Protocole de RT-PCR Quantitative en temps réel
Sonde Bcr1 1 2 3 4 5 6 RARa PML Sonde Bcr2 1 2 3 4 5 6 RARa PML Sonde Bcr3 1 2 3 Normalisation par rapport à un gène de ménage: Housekeeping gene

23 RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003
Comparaison Moelle - Sang

24 RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003
Risque de rechute et DFS selon cutoff de positivité après consolidation

25 RQ-PCR: nombre de copies au diagnostic et après 1 mois
107 106 105 Nombre de copies au diagnostic 104 103 102 10 Indétectable Diagnostic 1 mois

26 RQ-PCR: Positivité et Différenciation au diagnostic
1 mois après le Diagnostic N= 15 2 4 6 8 10 12 <50% >50% Positif Négatif Nombre de patients % de cellules différenciées à J3 de culture p=0.022 Corrélation entre différenciation au diagnostic et positivité en RQ-PCR à 1 mois

27 Suivi par RQ-PCR: Exemple de résultat
Rechute 106 105 104 Nombre de Copies Normalisé 103 102 10 Indétectable Mois

28 Conclusion Méthode de choix: RQ-PCR
- quantifier la qualité des échantillons - suivi cinétique de la réponse au traitement - suivi cinétique d ’une re-positivation - évaluer des seuils Objectifs : - établir un schéma précis des temps de prélèvements - Sang ou moelle ? - établir des seuils prédictifs de l ’évolution des patients * seuil après traitement : Induction? Consolidation? * seuil de re-positivation * seuil de positivité d ’un échantillon pour autogreffe - standardisation Question : traitement de la rechute moléculaire? Arsenic?

29 Protocole de prélèvements dans la leucémie aiguë à promyélocytes
Induction Consolidation Entretien Rémission Début Fin Fin /6 mois /6 mois MOELLE RQ-PCR Entretien Rémission 1/3 mois /6 mois SANG RQ-PCR

30 Références Bibliographiques
- David Grimwade The significance of minimal residual disisease in patients with t(15;17) Best Practice and research Clinical Haematology Vol15, n°1, p , 2002 - Grimwade D, Lo Coco F Acute promyelocytic leukemia: a model for the role of molecular diagnosis and residual disease monitoring in directing treatment approach in acute myeloid leukemia. Leukemia Oct;16(10): - Gallagher RE et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of PML-RARa mRNA in acute promyelocytic leukemia: assessment of prognostic significance in adult patients from intergroup protocol 0129 Blood Vol 101, n°7 p , 2003