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Invalidation du gène Tph1 chez la souris Rôle de la sérotonine circulante et implication de la sérotonine maternelle dans la fonction cardiaque. Cécile.

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1 Invalidation du gène Tph1 chez la souris Rôle de la sérotonine circulante et implication de la sérotonine maternelle dans la fonction cardiaque. Cécile FLIGNY – 14 JUIN 2007

2 La découverte de la sérotonine Erspamer & Vialli, 1937 Une substance isolée de la muqueuse gastrique provoque des contractions des muscles lisses: elle est nommée entéramine. Rapport et coll., 1948 Une substance présente dans le sang provoque la contraction des vaisseaux: elle est appelée sérotonine. Erspamer & Asero, 1952 Entéramine et sérotonine sont une seule et même substance. Twarog & Page, 1954 La sérotonine est un neurotransmetteur dans le cerveau des mollusques et est présente dans le cerveau des mammifères.

3 La sérotonine: fonctions biologiques Système nerveux central thermorégulation nociception mémoire et apprentissage cycle veille/sommeil comportement sexuel/maternel prise alimentaire humeur contractilité cardiaque tonus vasculaire Système cardiovasculaire Système sanguin fonction des lymphocytes hémostase Système gastro-intestinal péristaltisme Développement embryonnaire différenciation neuronale synaptogenèse division cellulaire morphogène développement cardiaque

4 La sérotonine: pathologies associées Système nerveux central schizophrénie douleur anxiété dépression comportements suicidaires agressivité migraine alcoolisme hypertension artérielle systémique et pulmonaire cardiopathie hypertrophique cardiopathie dilatée Système cardiovasculaire Système sanguin asthme thrombose Système gastro-intestinal tumeurs carcinoïdes syndrome du colon irritable Développement embryonnaire retard de croissance

5 Les acteurs du système 5-HT 1/ des récepteurs spécifiques 15 récepteurs 5-HT différents, répartis en 7 classes. 5-HT Na + R.à 7 domaines transmembranaires R. canaux (5-HT 3 ) Signalisation intracellulaire Récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G, à lexception du récepteur 5-HT 3. Expression dépendante de lorgane et de lespèce considérés. Les récepteurs de la classe 2 sont spécialement impliqués dans la régulation des fonctions cardiaques chez la souris.

6 Les acteurs du système 5-HT 2/ des mécanismes dinactivation Na + R. à 7 domaines transmembranaires R. canaux (5-HT 3 ) Signalisation intracellulaire Un mécanisme de recapture: Le transporteur de haute affinité SERT 5-HT R. 5-HT Recapture Ext. Int.

7 Les acteurs du système 5-HT 2/ des mécanismes dinactivation Na + R. à 7 domaines transmembranaires R. canaux (5-HT 3 ) SERT 5-HT R. 5-HT Signalisation intracellulaire Recapture 5-HT Un mécanisme de dégradation: La monoamine oxydase MAO 5-HIAA MAO VMAT

8 Les acteurs du système 5-HT 3/ une enzyme de synthèse limitante: la TPH Enzyme limitante de la voie de biosynthèse de la 5-HT tryptophane Décarboxylase des aa aromatiques 5-hydroxytryptamine SÉROTONINE noyaux du raphé neurones myentériques cellules entérochromaffines Mélatonine glande pinéale 5-hydroxytryptophane 5-HTP Tryptophane hydroxylase

9 Inactivation du gène Tph chez la souris locus Tph endogène locus Tph muté Vecteur de ciblage Stratégie de « knock-in » Les souris Tph -/- (+/-) sont viables Tph1 +/- x Tph1 +/-

10 Deux gènes Tph… glande pinéale *** neurones myentériques cellules entérochromaffines *** Effondrement du taux de 5-HT. Tph2 noyaux du raphé Taux de 5-HT normal. 2 gènes Tph

11 Lieux dexpression des gènes Tph 65% didentité TPH TPH1 Domaine catalytique 83% didentité Domaine de régulation et dinteraction Région 3 non traduite Biosynthèse de 5-HT TPH1 non neuronale Glande pinéale Cellules entérochromaffines TPH2 neuronale Neurones 5-HT du raphé Neurones myentériques 90% 5% Souris invalidées pour le gène Tph1

12 Temps dexpression des gènes Tph SNC Tph2 E10.5 intestins Tph1 E14.5 Naissance Sérotonine de lembryon glande pinéale Tph1 CE E15.5 Tph2 E12.5 NM

13 En résumé … parents adultes 100% de survie Souris viables Tph1 -/- (+/-) 3-15% 50% Tph1 +/- *** 3% 15%

14 Conséquences du faible taux de 5-HT circulante? Problèmes cardiaques Faible taux de 5-HT circulante Tph1 -/- (+/-) 3-15% dysfonctionnement?

15 La cathéterisation de conductance Volume Pression remplissage contraction éjection relaxation Volume Pression Courbe de fonction ventriculaire gauche = contractilité Insuffisance cardiaque

16 Le phénotype cardiaque est hétérogène Phase de compensation Tph1 -/- (+/-) 3-15% Tph1 +/+ Tph1 -/- Souris 273 Phase de décompensation Tph1 -/- Souris 296

17 Le phénotype cardiaque est hétérogène Tph1 -/- (+/-) 3-15% n=30n=7 n=30 n=7

18 Conclusion (1) parents adultes 100% de survie Souris viables Tph1 -/- (+/-) 3-15% 50% Tph1 +/- Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Hétérogénéité importante

19 Origine de lhétérogénéité du phénotype cardiaque? Tph1 -/- (+/-) 3-15% Le stress, un facteur aggravant de la cardiopathie? exacerbation du phénotype cardiaque en période de stress Le taux individuel de 5-HT, prédicateur de la sévérité du phénotype cardiaque?

20 Le stress, facteur aggravant de la cardiopathie? Tph1 -/- (+/-) 3-15% Protocoles envisageables: Exercice physique (marche forcée, nage). Une stimulation adrénergique. Protocole expérimental choisi: Test pharmacologique deffort avec la dobutamine. dobutamine Catécholamine de synthèse Agoniste 1-adrénergique Inotrope + ( force de contraction) Bathmotrope + ( conduction) Chronotrope + ( fréquence)

21 Aucune réserve contractile cardiaque… Tph1 -/- (+/-) 3-15% Survie (min) Souris Tph1 -/- (+/-) non sensiblessensibles Souris contrôles Survie moyenne des souris Tph1 -/- (+/-) après dobutamine: 11.4 ± 2.8 min. Souris Tph1 -/- Non sensibles Souris Tph1 -/- sensibles

22 Modification de la signalisation 5-HT cardiaque Tph1 -/- (+/-) 3-15% Étude de liaison des récepteurs -adrénergiques cardiaques Tph1 +/+ Tph1 -/- Kd (nmol/l) 0.03 ± ± 0.02 Bmax (fmol/mg prot.) ± ± 3.08 β 1 /β 2 (%) 51 ± ± 48 Tph1 +/+ Tph1 -/- 5-HT 2A (fmol/mg prot.) HT 2B (fmol/mg prot.) SERT (fmol/mg prot.) 1357 Ø modification de la signalisation -AR. Étude de liaison des récepteurs 5-HT cardiaques x 2 néoexpression

23 Conclusion (2) parents adultes 100% de survie Souris viables Tph1 -/- (+/-) 3-15% 50% Tph1 +/- Absence de réserve contractile cardiaque Hétérogénéité importante stress, facteur aggravant de la cardiopathie 5-HT 2B SERT Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque

24 Taux individuel de 5-HT, prédicateur de la cardiopathie? Tph1 -/- (+/-) 3-15% Protocole expérimental: Mesure des paramètres cardiaques de chaque animal par échocardiographie. Détermination des taux individuels de sérotonine circulante. Contrainte: Analyser un nombre important danimaux. Analyse des souris Tph1 -/- issues de mères Tph1 -/-. Générer un nombre important danimaux mutés dans une même portée Diminuer lhétérogénéité entre les individus dune même portée.

25 Seuls 20% des souris Tph1 -/- (-/-) survivent ! parents adultes 100% de survie Souris viables Tph1 -/- (+/-) 3-15% 50% Tph1 +/- 5-HT 2B SERT Tph1 -/- (-/-) Tph1 -/- (+/-) 3-15% Tph1 -/- (-/-) Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Stress aggrave la cardiopathie Très peu de naissance 20% de survie

26 Conséquences du faible taux de 5-HT maternelle? Génotype maternel Génotype paternel Nombre de croisements Génotype des embryons % dembryons petits / malformés +/++/--/- +/ / / /- +/ / / / / / malformations létales à ~E12 Tph1 -/- (-/-) Tph1 +/+ (+/+) Tph1 +/+ (+/-) Tph1 -/- (-/-) Tph1 +/- (-/-) La 5-HT maternelle est indispensable pour le développement embryonnaire normal. Embryons normaux

27 Seuls 20% des souris Tph1 -/- (-/-) survivent ! parents adultes 100% de survie Souris viables Tph1 -/- (+/-) 3-15% 50% Tph1 +/- 5-HT 2B SERT Tph1 -/- (-/-) Tph1 -/- (+/-) 3-15% ?? Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Stress aggrave la cardiopathie Très peu de naissance 20% de survie Tph1 -/- (-/-) ??

28 Quel phénotype cardiaque? Tph1 +/+ Tph1 -/- (+/-)Tph1 -/- (-/-) 2 mois5 mois 2 mois5 mois PPVGd (cm)0.07 ± ± ± ± 0.01 Ұ PPVGs (cm)0.10 ± ± ± ± 0.01 *** Ұ Ұ Ұ Sd (cm)0.08 ± ± 0.01 Ss (cm)0.10 ± ± ± 0.01 * Ұ Ұ DIVGd (cm)0.41 ± ± ± ± ± 0.05 ** Ұ DIVGs (cm)0.25 ± ± ± ± ± 0.05 ** Ұ Longueur VG (cm)0.82 ± ± ± ± ± 0.05 Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données anatomiques. Signes anatomiques de cardiopathie dilatée (CMD). Se développe entre 2 et 5 mois. Tph1 -/- (-/-) ?? Ø signe anatomique de cardiopathie à 2 mois.

29 Quel phénotype cardiaque? Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données fonctionnelles. Signes fonctionnels de CMD: FS (index de contractilité) 5 mois FS (%) FC (bpm) 2 mois Tph1 -/- (-/-) ??

30 Quel phénotype cardiaque? Mesure des marqueurs plasmatiques précoces dinsuffisance cardiaque. 5 mois Tph1 -/- (-/-) ?? BNP (pg/ml) CK-MB (µg/l) Troponine Ic (ng/ml) Influence du génotype maternel Augmentation plus importante chez les Tph1 -/- (-/-). Augmentation des marqueurs précoces dIC chez les Tph1 -/- (+/-) Les souris Tph1 -/- (+/-) développent une cardiopathie à un âge plus avancé

31 Conclusion (3) parents adultes 100% de survie Souris viables Tph1 -/- (+/-) 3-15% 50% Tph1 +/- 5-HT 2B SERT Tph1 -/- (-/-) Tph1 -/- (+/-) 3-15% ?? 20% de survie Très peu de naissance Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Stress aggrave la cardiopathie Augmentation ± des marqueurs dIC Augmentation +++ des marqueurs dIC Cardiopathie dilatée

32 La sérotonine circulante 5-HT 99% plaquettes sanguines 1% plasma Neurones myentériques (TPH2) Cellules entérochromaffines (TPH1) 90% de la sérotonine circulante est synthétisée dans les cellules entérochromaffines par la TPH1.

33 Taux de sérotonine plaquettaire? Tph1 -/- (-/-) ?? > 99% de la sérotonine circulante stockée dans les plaquettes sanguines. 5 mois Pas de corrélation entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plaquettaire. 5-HT sang total (µM) Même taux de 5-HT entre les souris Tph1 -/- (+/-) et Tph1 -/- (-/-).

34 Taux de sérotonine plasmatique? Tph1 -/- (-/-) ?? < 1% de la sérotonine localisée dans le plasma sanguin. 5 mois 5-HT plasma (nM) Taux de 5-HT plasmatiques significativement diminués entre les Tph1 -/- (+/-) et -/- (-/-).

35 Corrélation 5-HT / cardiopathie? Tph1 -/- (-/-) ?? 5-HT plasma BNP corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique. La sérotonine active pour la régulation de la fonction cardiaque est localisée dans le compartiment plasmatique sanguin.

36 Conclusion (4) parents adultes 100% de survie Souris viables Tph1 -/- (+/-) 3-15% 41% 50% Tph1 +/- 5-HT 2B SERT Tph1 -/- (-/-) Tph1 -/- (+/-) 3-15% 20% de survie Très peu de naissance Diminution contractilité cardiaque Insuffisance cardiaque Stress aggrave la cardiopathie Augmentation ± des marqueurs dIC Cardiopathie dilatée Augmentation +++ des marqueurs dIC corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique. Le génotype maternel influence le taux de 5-HT plasmatique 3-15% 20%

37 Le génotype maternel régule le taux de 5-HT plasmatique? Naissance Sérotonine de lembryon Sérotonine maternelle Tph2 Tph1 E10.5 Tph1 Tph2 E14.5 E15.5 E HT2B SERT

38 diminution de la production de 5-HT dans les intestins des souris Tph1 -/- (-/-)? augmentation du catabolisme de la 5-HT? Peu probable car la concentration plaquettaire de 5-HT est la même entre les groupes de souris Tph1 -/-. modification du nombre, de la fonction (capture de 5-HT, capacité de dégranulation) et/ou de la structure (capacité de stockage de la 5-HT) des plaquettes? La 5-HT maternelle régule le taux de 5-HT plasmatique? Tph1 -/- (-/-)

39 Les plaquettes sanguines Tph1 -/- (-/-) 20% Diminution du nombre de plaquettes en fonction du génotype maternel. 5 mois Plaquettes (10 3 /µl) Nombre de plaquettes sanguines. La sérotonine maternelle régule le nombre de plaquettes sanguines

40 … une première piste? Plaquettes sanguines mégacaryocytesproplaquettesplaquettes Réarrangement du cytosquelette 5-HT 2A SERT 5-HT 2A ? 5-HT 2B ? SERT 5-HT 2B SERT 5-HT Sérotonine

41 Limplication des petites protéines G? cardiomyocytes adultes 5-HT 2B x 2 5-HT SERT x 5 mégacaryocytes 5-HT 5-HT 2B SERT Maintien du phénotype 5-HT foetal Réarrangement anormal du cytosquelette Formation anormale du cytosquelette activation petites protéines G (RhoA?) contractilité cardiomyocytes maturation Mégacaryocytes / proplaquettes

42 sérotonine maternelle Études épidémiologiquesEnvironnement maternel Autisme Maladies psychiatriques Diabète Obésite…


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