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Diagnostic des infections à gonocoque par techniques moléculaires H. Hochard, C. Delamare CHR Metz Thionville Diagnostic des infections à gonocoque et.

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1 Diagnostic des infections à gonocoque par techniques moléculaires H. Hochard, C. Delamare CHR Metz Thionville Diagnostic des infections à gonocoque et à Chlamydia trachomatis par techniques moléculaires mardi 11 septembre 2012 H. Hochard, C. Delamare CHR Metz-Thionville

2 EPIDEMIOLOGIE

3 Renago, 2008 Plus de déclaration obligatoire depuis 2000 pas de données de prévalence Estimation de lincidence grâce aux réseaux : RENAGO de laboratoires, dont les patients consultent majoritairement en médecine de ville RésIST de cliniciens, dont les patients consultent quasi- exclusivement dans des structures spécialisées (CIDDIST et CDAG) Neisseria gonorrhoeae (NG)

4 Réseaux de surveillance augmentation des infections gonococciques population homosexuelle masculine, mais aussi hétérosexuelle masculine et féminine médiane âge femmes infectées 24 ans vs 27 ans pour les hommes portage asymptomatique (plus fréquent +++ chez la femme : % vs < 1 % chez lhomme), favorise la transmission augmentation des résistances

5 Évolution du nombre moyen de gonocoques isolés par laboratoire actif et par an selon le sexe (réseau Rénago) Augmentation de la fréquence de linfection chez lhomme (+26%) comme chez la femme (+33%) entre 2008 et 2009

6 Évolution du nombre moyen de gonococcies par site participant et par an selon le sexe (réseau RésIST)

7 Absence de recommandations de dépistage en France Recommandations européennes (IUSTI - OMS, 2001, actualisées 2008) En présence de symptômesEn labsence de symptômes symptômes ou signes découlements urétraux chez lhomme jeune adulte dépisté pour une IST orchi-épididymite chez lhomme de moins de 40 ans partenaire sexuel dune personne ayant une IST ou une atteinte inflammatoire pelvienne écoulement vaginal avec facteurs de risque dIST nouveaux ou multiples partenaires cervicite mucopurulente inflammation pelvienne aiguë

8 Chlamydia trachomatis (CT) 1 er agent bactérien responsable dIST dans les pays industrialisés Réseau de surveillance : RENACHLA (laboratoires) incidence 4 % infections asymptomatiques chez 75 % des femmes et 50 % des hommes prévalence varie en fonction : des populations étudiées (lieu de recrutement) de lâge : maximale chez les femmes de 18 à 24 ans et chez les hommes de 25 à 30 ans

9 Réseau Rénachla HOMMES Augmentation du nombre de diagnostics de 19 % chez lhomme entre 2008 et 2009 Chlamydia trachomatis (CT)

10 Réseau Rénachla FEMMES Augmentation du nombre de diagnostics de 25 % chez la femme entre 2008 et 2009

11 Estimation de la prévalence en France des infections à CT dans la population générale personnes testées ans Auto-prélèvement vaginal (femmes) ou urine (hommes) : à domicile – ans : Hommes = 1,4% Femmes = 1,6% – ans : Hommes = 2,5% Femmes = 3,2% Prevalence of Chlamydia trachomatis: results from the first national population-based survey in France. Goulet V, de Barbeyrac B, Raherison S, Prudhomme M, S le C, Warszawsk J; CSF group. Sex Transm Infect Aug;86(4):

12 HAS 2003 personne symptomatique CIDDIST, CDAG : dépistage systématique chez les femmes de 15 à 25 ans et les hommes < 30 ans quels que soient lâge et le sexe si >1 partenaire dans lannée un ou une partenaire infecté(e) à C. trachomatis

13 DIAGNOSTIC

14 Diagnostic direct –détection de Neisseria gonorrhoeae dans les différents milieux accessibles à un prélèvement (urètre, endocol, urines…) culturepar culture biologie moléculairedétection du génome bactérien par biologie moléculaire Diagnostic indirect : sérologique, qui met en évidence les anticorps –inapproprié dans le cadre dun dépistage et dun diagnostic Neisseria gonorrhoeae

15 Chlamydia trachomatis Détection du génome bactérien par biologie moléculaire avec amplification génique –Sensibilité > 95% –Spécificité > 99% Adaptée dans toute situation clinique et pour tout type de prélèvement Les techniques de détection directe de CT par identification des inclusions intracellulaires sur culture ne sont plus recommandées. Il est préconisé de ne plus utiliser la technique de détection directe par méthode immunologique. Aucun intérêt de la sérologie dans les infections basses DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LINFECTION Á CHLAMYDIA TRACHOMATIS HAS Juillet 2010

16 Les prélèvements Culture (NG) endocol urètre écoulement urétral anal pharyngé Tests moléculaires endocol vagin (auto- prélèvement) urètre sperme urine anal pharyngé

17 Tests moléculaires (1 seul écouvillon pour NG et CT ) matériel de prélèvement avec milieux de transport spécifiques aux différents tests de diagnostic moléculaire non interchangeables important dadresser au laboratoire le milieu en adéquation avec la technique de diagnostic à titre dexemple : –milieu Abbott contient du thiocyanate de guanidium qui inhibe la PCR Cobas Roche, car la libération des acides nucléiques associée a cette technique est une lyse et non une extraction nélimine pas le thiocyanate Culture (NG) milieu de transport gélosé ! inhibition PCR Les milieux de transport

18 réalisée en systématique pour toute demande de culture visualisation directe du gonocoque sous la forme de diplocoques à Gram négatif intracellulaires « en grain de café » sensibilité : –élevée en cas durétrite aiguë chez lhomme (sensibilité > 95 %) –mauvaise chez les hommes asymptomatiques (50 à 75 %) et chez la femme à partir des prélèvements endocervicaux et urétraux (respectivement 45 à 65 % et 20 %) non adaptée aux localisations anorectales et pharyngées –présence de cocci à Gram négatif appartenant à dautres espèces bactériennes –sensibilité 40 % NG : La microscopie (coloration de Gram)

19 Patients symptomatiques : méthode de référence {IUSTI/WHO 2008} Milieu de culture (gélose chocolat) sélectif contenant des antibiotiques (VCN) // Milieu non sélectif Avantages : –faible coût –sensibilité : 90% (80 à 96 % selon les études) pour les prélèvements durètre, % pour les prélèvements cervicaux – permet la réalisation dun antibiogramme et dun typage pour les études épidémiologiques Inconvénients : –nécessité deffectuer des prélèvements invasifs – transport rapide vers le laboratoire –délai dobtention des résultats de 2 à 3 jours –sensibilité faible pour pharynx et anus (respectivement < 50 % et < 60 %) NG : La culture

20 Détection des acides nucléiques du génome bactérien (ADN ou ARN) Différentes techniques : –( hybridation moléculaire ) –techniques d amplification génique PCR TMA SDA Les tests de biologie moléculaire

21 PCR ( Polymerase chain reaction ) Amplification cyclique dun segment dADN cible 3 températures : dénaturation –95°C : dénaturation de lADN hybridation –entre 50 et 65°C : hybridation des amorces oligonucléotidiques complémentaires à leurs régions cibles élongation –70°C : élongation dans le sens 5 3 des amorces par Taq polymérase 40 cycles : 10 6 fois la cible

22 SDA ( Strand Displacement Amplification ou amplification par déplacement de brin ) Amplification isothermique dADN 2 enzymes thermorésistantes : –une enzyme de restriction –une ADN polymérase 2 couples d'amorces ADN cible possédant ce site de restriction est généré à l'aide de la polymérase

23 TMA (Transcription Mediated Amplification) Amplification isothermique d ARN (via un intermédiaire ADN) 2 enzymes : –ARN polymérase –transcriptase inverse (+ RNAse) synthèse dun ADN double brin transcriptible en ARN par la transcriptase inverse amplification par lARN polymérase : transcription dune série dARNs (50 à 100 copies) Les ARNs synthétisés servent à leur tour de matrice pour la synthèse dun ADNdb.

24 Hybridation directe à laide de sondes ADN –Gen-Probe PACE 2 ® (sonde ADN qui shybride à lARN ribosomal du gonocoque) peu utilisée en France pour NG : moins sensible et moins spécifique que la culture pas utilisée pour CT Sonde dhybridation

25 Roche Cobas Amplicor CT/NG® Abbott RealTime CT/NG® BD ProbeTec CT/NG® Gen-Probe Aptima Combo 2 CT/NG® Automatisationoui Technique damplification PCR SDATMA Système de détection colorimétriefluorescence chemiluminescence Prélèvements acceptés Urine Urétral Endo-cervical Urine Urétral Endo-cervical Vaginal Urine Urétral Endo-cervical Urine Urétral Endo-cervical Vaginal

26 Sensibilité des techniques NG : sensibilité = 96,0 à 97,8 % spécificité = 98,1 à 98,9 % CT : sensibilité = 88,9 à 95,9 % spécificité = 96,6 à 98,9 %

27 Performance des tests moléculaires Sensibilité et spécificité élevées –varient en fonction de la technique d'amplification utilisée et du site de prélèvement Sensibilité sur les prélèvements cervicaux > urine (Sensibilité sur les prélèvements urétraux légèrement > urine) Chez les individus asymptomatiques : performance des tests moléculaires supérieure à celle de la culture (NG)

28 NG : Nécessité de confirmer les résultats du test initial par une autre technique damplification ? Existence de résultats faux-positifs, quelle que soit la technique damplification Contrôle des positifs par une autre technique, ciblant une séquence différente du génome CHR Metz-Thionville, laboratoire de Metz : collaboration avec Dr Patricia Franck Responsable Filière Biologie médicale Maternité régionale universitaire de Nancy

29 Avantages des techniques moléculaires détection possible dans des prélèvements inadaptés à la culture (urine, prélèvements vaginaux) ne requièrent pas la viabilité des bactéries milieux de transport stables plusieurs jours délai de rendu des résultats plus court automatisation adaptation aux grandes séries

30 Mise en place de la méthode Abbott RealTime CT/NG ® au laboratoire de Metz

31 Etude réalisée en 2010 (6 mois) 1085 prélèvements : -36 reçus (31 patients) pour recherche spécifique de Neisseria gonorrhoeae reçus pour recherche de Chlamydia trachomatis Origine des prélèvements : dont 12% vagin

32 Recherche spécifique de Neisseria gonorrhoeae : 31 patients CIDDIST (9 femmes et 22 hommes) Age médian : 25 ans Symptomatiques : 3 femmes (33%) et 10 hommes (45%) Positifs NG : 3 patients (1 femme, 2 hommes) = 9.7% Résultats

33 Recherche systématique de Neisseria gonorrhoeae : 1049 patients 322 CIDDIST - Age médian : 22 ans - Symptomatiques : 11 (3,4%) - Facteurs de risque : 159 (49%) - Positifs NG : Gynécologie-Obstétrique grossesses asymptomatiques Positifs NG : 2 (0,19%) UGO dont 468 symptomatiques Positifs NG : 0 Résultats

34 Fréquence chez les sujets asympto = 0,34 % (2/588) Fréquence chez les sujets sympto = 0,61 % (3/492) Au total : 5/1080 soit 0,46 % Conclusion

35 6251 prélèvements recherche de NG sur prescription : 361 –291 CIDDIST –45 UGO –18 extérieurs –7 prison Positifs CT : 4,7 % (293) Positifs NG : 0,66 % (41) (0,46 % en 2010) –recherche sur prescription (18/361) : 4,99 % –recherche systématique (23/5889) : 0,39 % août 2012

36 CONCLUSION

37 Patient symptomatique : culture = gold standard –homme : écoulement, urètre –femme : sécrétions endocol SAUF localisations anales et pharyngées : biologie moléculaire (sensibilité >> culture) La culture peut être associée à la biologie moléculaire si les conditions de transport risquent daffecter la survie de NG (délai dacheminement, température). Neisseria gonorrhoeae

38 Personne asymptomatique (dépistage) : biologie moléculaire (tests multiplex NG/CT) performance > culture prélèvements non invasifs (meilleure acceptabilité) –homme : 1 er jet urine –femme : auto-prélèvement vaginal –si positif : confirmer par 2 ème technique de biologie moléculaire ciblant une séquence différente (taux prévalence population dépistée < 5%) reprélever pour culture et antibiogramme

39 Toutes les recherches seffectuent par techniques moléculaires. –homme sympto/asympto : 1 er jet urine (urètre) –femme symptomatique : endocol (+ urètre ou vagin) asymptomatique : auto-plvt vaginal (1 er jet urine) Chlamydia trachomatis

40 Merci de votre attention…


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