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III -La Chromatographie liquide haute performance Les différents type de Chromatographie Liquide Lappareillage La chromatographie dadsorption La chromatographie.

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1 III -La Chromatographie liquide haute performance Les différents type de Chromatographie Liquide Lappareillage La chromatographie dadsorption La chromatographie de polarité de phase normale La chromatographie de polarité de phase inverse Les modes de travail Les détecteurs Les domaines dapplication La chromatographie planaire

2 2 1- Les différents types de CL Domaines dapplication –Masse molaire élevée > g/mol Espèces non polaires : perméation sur gel Espèces polaires ou ioniques : filtration sur gel –Espèces ioniques à faible masse molaire Echange dions –Petites molécules non ioniques Chromatographie de partage Soluté Phase stationnaire Phase mobile

3 3 2- Lappareillage 2-1- Le chromatographe Chaque paramètre chromatographique doit être optimisé pour assurer lanalyse qualitative et quantitative –La phase mobile –La phase stationnaire –Dimension de la colonne –Le volume dinjection –Le traitement de léchantillon –Le débit de la phase mobile –La température de la colonne –Le détecteur Pompes Injecteur Colonne Détecteur Solvants délution Dégazeur Collecte de données

4 Les solvants Compatibilité avec le système de détection –Pas dabsorption aux longueurs donde de travail (détection par absorption) –Indice de réfraction de la phase mobile différent de celui des solutés (détecteur réfractomètres) Miscibilité et solubilité des solutés Viscosité –Une augmentation de la viscosité diminue les coefficients de diffusion et de transfert de masse : diminution du nombre de plateaux théoriques –La pression en tête de colonne augmente proportionnellement à la viscosité de la phase mobile Température débullition –Problème de dégazage Pureté des solvants –Alcanes transparents jusquà 190 nm mais les traces doléfines absorbent vers 250 nm –Oxygène dissout augmente la longueur donde limite de détection Toxicité et dangerosité –Attention aux solvants chlorés et aromatiques Force éluante Polarité Coefficient de partage eau/octanol

5 Les problèmes de dégazage et les dégazeurs Détérioration de la colonne Bruit lié à la pompe Problème de détecteur Les dégazeurs Dégazage à lhélium Dégazage sous vide Dégazage par ultra sons Efficacité du dégazage

6 Les pompes –Assurent lécoulement de la phase mobile dans la colonne –Doivent être près puissantes : P = 420 bars Viscosité des solvants Granulométrie de la phase stationnaire –Généralement pompes à pistons alternatifs Petit volume interne Pression de sortie élevée (700 bars) Débit constant quelque soit la pression dans la colonne –Attention aux propriétés physiques de remplissage des colonnes: doivent résister à de fortes pressions

7 7 Pompe isocratique - 1 seul solvant délivré - Travail en mode isocratique Pompe binaire: 2 pompes Avantages - Faible chambre de mélange - Travail en mode gradient - Mélange des solvants à haute pression - Gradient le plus reproductible (débit et composition extrême) - Gradient le plus rapidement délivré Inconvénients - Plus complexe et plus cher - Problèmes de cavitation avec certains solvants Pompe quaternaire Avantages - Maximum 4 solvants délivrés - Travail en mode gradient - Une seule tête de pompe - Prix plus faible Inconvénients - Moins performants aux conditions extrêmes - Gradient moins précis et reproductible - Nécessite un dégazage en ligne

8 Linjecteur Vanne à haute pression à 6 voies –Injection brève pour ne pas perturber le régime découlement dans la colonne –Grande reproductibilité

9 La colonne Généralement courtes et en acier inoxydable –Longueur de 10 à 25 cm –Diamètre de 4 à 5 mm Elles sont remplies de phase stationnaire –Billes de 5 à 10 µm de diamètre –Phase liquide déposée sur des billes (silice) Nombre de plateaux théoriques varie de 1000 à Souvent précédée dune colonne de garde u Colonne d c Diamètre d c Volume V C = V M + V S Phase mobile (Eluant ) Viscosité Volume V M = V i + V p V i Intergranulaire V p Porosité (stagnation) Vitesse découlement u Phase stationnaire Particules de taille moyenne d p Volume V S

10 10 Porosité de la colonne Intergranulaire Intragranulaire Totale Facteur de résistance Perméabilité spécifique de la colonne K 0 Lois de Darcy P = P e -P s : perte de chargeL : longueur de colonne En général : T = i

11 Les détecteurs - Termes généraux et concepts Sélectivité –Un détecteur non sélectif réagit avec la solution qui passe dans la cellule. quand un composé est élué… –Un détecteur sélectif ne réagit pas avec la solution mais mesure une réponse due à une propriété de la molécule de soluté (i.e. UV absorbance) Sensibilité –Plus petit signal détectable: signal/bruit=3 Domaine de linéarité –Pente et interception Limite de détection et de quantification –Limite de détection = la plus petite quantité danalyte qui peut être détectée (3 fois le bruit de fond) –Limite de quantification = la plus petite concentration danalyte, dans une certaine matrice, qui peut être mesurée (10 fois le bruit de fond)

12 12 Détecteurlinéaritésélectivitésensibilité UV5moyenne0,5 – 1,0 ng Indice de réfraction4faible1 – 5 µg fluorescence2grande10 – 100 pg Conductivitéfaible10 – 50 ng électrochimique2grande50 – 500 pg Spectrométrie de masse3-4grande10 – 100 fg

13 Détecteur UV-Visible Détecteur le plus utilisé en HPLC –Rempli un nombre important de critères du détecteur idéal Sensibilité Linéarité Réponse pas affectée par des fluctuations de température Sélectif et utilisable en gradient délution Mesure de labsorbance : loi de Beer-Lambert

14 Gamme de longueurs donde : 210 – 850 nm –180 – 380 nm : lampe deutérium –380 – 800 nm : lampe tungstène

15 Le détecteur à barrettes de diodes Détection à une seule ou à plusieurs Acquisition dynamique du spectre Obtenir le spectre de chaque composé Détection simultanée à 2 (pureté) Soustraction de (compensation de dérive de ligne de base) Déconvolution des spectres

16 Phénomène de co-élution de pics Analyse de pureté de pics avec un D.A.D. ( diode array détector ) : déconvolution

17 Détecteur fluorimétrique Luminescence –Absorption dun photon : augmentation de lénergie – passage de S 0 à un état singulet S 1 ou S 2 –Perte dénergie selon différents processus Luminescence (état excité à état fondamental) –Photoluminescence lorsque la lumière est source dexcitation Fluorescence –Energie absorbée est distribuée en niveau de rotation et vibration –Retour à létat fondamental sans émission de lumière : relaxation –Puis émission dénergie phosphorescence Emission se fait à supérieur

18 Lampe Spectre entre 200 et 900 nm Monochromateur à réseau concave diffracte la lumière vers la cellule Lentille et miroir focalisent et dirigent la lumière vers le réseau démission Cellule en quartz Monochromateur disperse la lumière émise et la dirige vers le photomultiplicateur La lumière est collectée à angle droit et focalisée par la lentille Photocathode qui convertit les photons en électrons Photodiode mesure le spectre démission

19 3- La chromatographie dadsorption Phase stationnaire solide –Silice ou alumine Phase mobile –Caractérisée par la force éluante ε 0 : énergie dadsorption du solvant par unité de surface –ε 0 pour lalumine (ε 0 silice = 80% ε 0 alumine ) 19 Solvantε0ε0 Toluène0,29 Ether éthylique0,38 Chloroforme0,40 Dioxane0,56 Tetrahydrofurane0,57 Acétate déthyle0,58 Solvantε0ε0 Fluoroalcanes-0,25 Cyclohexane-0,2 n-hexane0,01 CCl40,18 1-chlorobutane0,26 Ether isopropylique 0,28 Solvantε0ε0 Nitrométhane0,64 Acétonitrile0,65 Méthanol0,95 Éthanol0,88 Ethylène glycol 1,11 eauélevée Augmentation de ε 0 de 0,05 unité diminue k dun facteur compris entre 3 et 4 Ordre délution des composés –Paraffines –Oléfines –Hydrocarbures aromatiques –Halogénures, sulfures –Éthers –Dérivés nitrés –Esters, aldéhydes, cétones –Alcools, amines –Sulfones –Sulfoxydes –Amides –Acides carboxyliques

20 4- Chromatographie de partage 4-1-Généralités Peut être subdivisée en deux –Chromatographie liquide/liquide (applications marginales) Phase stationnaire retenue par adsorption sur le support –Chromatographie liquide/phase greffée (majorité des applications) Phase stationnaire liée chimiquement au support Support : à base de silice Particules uniformes Particules poreuses et mécaniquement stables Particules de diamètre de 3, 5 ou 10 µm Surface entièrement hydrolysée 20

21 21 Les phases stationnaires (Obtenues par réaction de silanisation) Réaction dun chlorosilane (mono, di ou tri) avec les groupements silanols Monochlorosilane fournit un matériel monomérique lié à la surface par une liaison simple (liaison silyl ether) –Les phases monomériques sont très efficaces –Celles produits avec des di- et tri-chlorosilane sont plus robustes Les phases greffées sont très utilisées car elles changes la chimie de surface et donc la sélectivité

22 22 Les phases mobiles –Classées selon leur polarité: indice de polarité de Snyder (P) basée sur des mesures de solubilité de la substance étudiée dans 3 solvants –Dioxane (accepteur de proton à faible moment dipolaire) –Nitrométhane (accepteur de proton à moment dipolaire élevé) –Éthanol (donneur de proton à moment dipolaire élevé) SolvantP Toluène2,4 Ether éthylique2,8 Tetrahydrofurane4,0 Chloroforme4,1 Ethanol4,3 Acétate déthyle4,4 SolvantP Fluoroalcanes<-2 Cyclohexane0,04 n-hexane0,1 1-chlorobutane1,0 CCl41,6 Ether isopropylique2,4 SolvantP Dioxane4,8 Méthanol5,1 Acétonitrile5,8 Nitrométhane6,0 Ethylène glycol6,9 eau10,2

23 4-2- Chromatographie à polarité de phase normale (NP) Définition: la chromatographie en phase normale utilise une phase stationnaire plus polaire que la phase mobile –Phase stationnaire: silice greffée cyano, diol et amino –Phase mobile: hexane, chloroforme, ethylacétate Les analytes polaires sont retenus plus longtemps dans la colonne que les composés moins polaires Le groupe le plus polaire guide la rétention CH 3 : les moins retenus Aromatiques : rétention plus forte du fait des électrons Halogènes : moment dipolaire Ether Nitro Ester Aldéhyde Cétone Alcool : liaisons hydrogène Amine Amides Acides la polarité du solvant augmente dans le sens de la flèche PHASE NORMALE adsorbant polaire et très polaire la polarité de l'échantill on augmente

24 24 Optimisation de la phase mobile Différents solvants peuvent modifier la sélectivité –Utilisation de nomographe Exemple –Élution par 92% n-pentane – 8% methylacétate Faible sélectivité Durée correcte –Remplacement par 62% n-pentane 38% methylènechloride

25 4-3- Chromatographie à polarité de phase inversée (RP) Définition : la chromatographie en phase inverse utilise une phase stationnaire moins polaire que la phase mobile –Phase stationnaire est hydrophobe et liée chimiquement à un support de silice: octadecylsilyl (C18), octylsilyl (C8) et C4 –Phase mobile: eau, acétonitrile, méthanol, THF, tampons 25 la polarité du solvant augmente dans le sens de la flèche PHASE INVERSÉE adsorbant peu polaire la polarité de l'échantillon augmente

26 Leau est le solvant le plus faible car il est le plus polaire - repousse les analytes hydrophobes vers la phase stationnaire - les temps danalyse sont longs Le modificateur est moins polaire que leau - lanalyte est moins repoussé vers la phase stationnaire - temps de rétention plus faible Plus on ajoute de modificateur plus les temps de rétention sont courts Changer le modificateur change la sélectivité et la rétention (changement de polarité)

27 Changer le modificateur change la sélectivité et la rétention (changement de polarité)

28 28 Utilisation dun nomographe –Permet de sélectionner un autre solvant –Pour une durée délution à peu près identique( isoéluotropique) –Pour une sélectivité différente

29 29 Rétention en chromatographie de phase inverse Le caractère hydrophobe est le premier indicateur dune rétention –le caractère hydrophobe sexprime par log P (partition entre eau – octanol) –plus log P est grand plus le composé est hydrophobe Lordre délution est gouverné par la solubilité et le nombre datome de carbone –moins le composé est soluble, plus la rétention est grande –la rétention augmente avec le nombre datomes de carbone –les composés ramifiés sont élués plus rapidement que leurs isomères linéaires –les insaturations diminuent la rétention Lordre général délution est: –les espèces ioniques sont élués avec les volumes vides –acides forts –acides faibles –bases faibles –dipôles permanents –dipôles induits –aliphatiques Rétention croissante Solubilité dans leau croissante

30 30 5- Les modes de travail Mode isocratique –la composition de la phase mobile reste inchangée –Certains problèmes peuvent survenir grande diversité de polarité des analytes temps délution long mauvaise sensibilité pour les composés très retenus car les pics sont larges possibilité de rétention irréversibles conduisant à des contaminations Mode à gradient délution –la composition de la phase mobile change au cours de lanalyse –la composition initiale est choisie pour séparer les composés les plus rapidement élués –la force délution est augmentée pour éluer les composés avec une sélectivité optimum –la composition finale est choisie pour éluer lensemble des composés dignes dintérêt –il est possible daugment la force éluante pour éliminer les composés très retenus pouvant conduire à des contaminations

31 Phase normale ( LC-NP)Phase inverse (LC-RP) Gradient délution Polarité croissante de léluant Polarité décroissante de léluant Exemple Hexane + proportion croissante dacétate déthyle Eau + proportion croissante dacétonitrile Ordre délutionLes solutés les moins polaires sont les plus rapides Les solutés les plus polaires sont les plus rapides

32 6- Optimisation 32 Lefficacité a une grande influence sur la résolution Les paramètres ayant une influence sur lefficacité sont Longueur de la colonne (doubler la longueur double N) Taille des particules d P Volume vides Débit

33 Le meilleur moyen de modifier la rétention est de changer la force du solvant – une augmentation de 10% du modificateur diminue k dun facteur 2 ou 3 –Le gain maximal de la résolution est quand k est compris entre 1 et 5 La sélectivité a une grande influence sur la résolution Les paramètres ayant une influence sur la sélectivité sont La phase mobile La température La phase stationnaire

34 Exercice dapplication : Les facteurs de rétentions de 2 solutés sur une colonne C18 (L = 15 cm ; d C = 4,6 mm; = 70% ) sont respectivement 0,96 et 1,07 ; La phase mobile est un mélange H 2 O/MeOH 40/60 ; Le temps mort est t m = 2,3 min On décide de doubler la longueur de colonne en conservant le même débit ; A ) Déterminer : - Le volume mort de la colonne - Les temps de rétention et le temps mort du système - Les facteurs de rétention

35 B ) Comment vont évoluer les paramètres suivant : - La sélectivité - Lefficacité - La résolution

36 7- La chromatographie de surface ou planaire Elle peut se faire –Sur papier –Sur couche mince (plaque daluminium ou de verre sur laquelle est déposée la phase stationnaire) Elle exploite les phénomènes: –Dadsorption –De partage –Déchange dions La phase stationnaire –Silice, alumine, cellulose –Plus un composé est polaire plus il sera fortement adsorbé La phase mobile –Solvants plus ou moins polaires purs ou en mélange –Plus léluant est polaire plus les composés se déplacent rapidement 36

37 CCM (Chromatographie sur Couche Mince) Principe: adsorption –La phase stationnaire solide est fixée sur un support adsorbant inerte. –La phase mobile, non miscible avec la phase stationnaire, migre par capillarité. 37 Révélation –UV –Diiode, permanganate, ou autres réactifs chimiques spécifiques Rapport frontal Rf Résolution R Efficacité N hihi H


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