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B Barrou, EFPMO Juin 2010 Lésions dischémie reperfusion : le cauchemar du transplanteur.

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1 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Lésions dischémie reperfusion : le cauchemar du transplanteur

2 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Lésions dhypoxie Lésions dhypothermie Réaction inflammatoire Ischémie froideReperfusion Lésions liées à la réoxygénation Lésions liées au réchauffement/ Apoptose induite par la conservation Lésions chroniques Principaux mécanismes lésionnels au cours de lischémie reperfusion T Hauet

3 B Barrou, EFPMO Juin 2010 En cas de DDAC : des lésions en 3 temps… Ischémie HypothermieRevascularisation

4 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Lésions dischémie reperfusion : Conséquences cliniques Effet respectif de la reprise retardée de fonction et du rejet aigu (Tx rénale) Ni RRF ni RA RA RRF RRF + RA Effet à long terme

5 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Rôle central de la mitochondrie Chaque jour un adulte utilise (et recycle) une quantité d'ATP équivalente à 75 % de son poids corporel ! Dans les conditions de repos, un tiers est utilisé pour le fonctionnement des pompes membranaires comme les ATPases

6 B Barrou, EFPMO Juin 2010 La phosphorylation oxydative Mitochondrie matrice membrane interne membrane externe espace intermembranaire réactions d oxydo- réduction: transfert d e- I III IV CoQ CoQH 2 NaDH,H + FADH 2 NaD + FAD H+ 1/2 O 2 H2OH2O F1 F0 H+ ADP + Pi ATP II

7 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Ischémie = arrêt de la phosphorylation oxydative - O2 lactate glucose glycolyse pyruvate ATP +O 2 NADH, H+ acétyl CoA cycle de Krebs NADH, H+ FADH 2 Acidose

8 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Le bilan énergétique nest pas brillant… 1 mole de glucose Métabolisme aérobie 38 moles dATP Métabolisme anaérobie 2 moles dATP 2 mol. da lactique

9 B Barrou, EFPMO Juin O21O2 O2O2 h H2O2H2O2 OH ° O2 °-O2 °- e- O 2 ° - = anion superoxyde OH ° = radical hydroxyle H 2 O 2 = peroxyde d hydrogène 1 O 2 = oxygène singulet 4 e- H 2 O Tetraréduction Monoréduction physiologique Il existe une production radicalaire physiologique au niveau mitochondrial 95% 3 à 5%

10 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Quest-ce quun radical libre ? Un radical libre (RL) est constitué par tout atome, groupe datomes ou molécules où au moins un électron non apparié occupe une orbitale externe [ ] Le radical sen trouve doté dune réactivité particulière et peut ainsi réagir avec dautres atomes ou molécules et se comporter, selon le cas, comme un oxydant ou comme un réducteur, afin dapparier son électron célibataire Radical libre… de nuire ! Bref, cest la patate chaude… B Barrou, T Hauet EFPMO Juin 2009

11 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Conséquences de lischémie : la lecture biochimique ischémie Privation dO² et nutriments Accumulation de déchets Inhibition du métabolisme oxydatif Déplétion en ATP Glycolyse anaérobie Inhibition pompes Na/K Acide Lactique Ph Instabilité lysosomale Libération Enzymes lytiques Pertes électrolytes Œdème intraCel. Activité protéases et phospholipases Ouv canaux Ca++ Ca++ cytosol hypoxanthine Production radicaux libres Altération cytosquelette, protéines Peroxydation lipides membranaires

12 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Le paradoxe de la reperfusion Ischémie Reperfusion

13 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Syndrome de reperfusion Perico N, Lancet 2004, 364: X 100

14 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Conséquences immunologiques de lIRI

15 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Conséquences de lischémie : la lecture immunologique Ligands endogènes des TLR ischémie Immunité innée Alloreconnaissance lésions tissulaires Engagement TLR sur DC Maturation DC Migration DC vers OL II Activation des LT naifs Ag spécifique Alloantigène Evènements Ag indépendants, non spécifiques CD80 CD86 sur DC Evènements Ag dépendants, spécifiques La costimulation indispensable provient de lischémie via la voie des TLR

16 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Théorie du signal danger version chirurgicale Alloreconnaissance + inflammation

17 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Ligands endogènes des TLR : les «DAMPs» damage associated molecular pattern molecules TLRs, including TLR2 and TLR4, could function as: –detectors of sterile (not pathogen-associated) injury upon binding to endogenous ligands released by damaged cells –damage-associated molecular patterns, (DAMPs). Examples of putative endogenous ligands –heat-shock proteins, –high-mobility group box 1 (HMGB1), –heparan sulfate, –hyaluronan fragments, –fibronectin. Is it true in the clinical setting ?

18 B Barrou, EFPMO Juin 2010 TLR4 Expression Human kidney biopsy before reperfusion Krüger et al. Blood 2009 Cold isch: 0.5 h (n=15) Cold isch: 20 h (n=9) 1.TLR4 is expressed in normal human kidneys 2.TLR4 is significantly upregulated by ischemic injury

19 B Barrou, EFPMO Juin 2010 HMGB1 expression in implantation biopsies Krüger et al. Blood 2009 LD = living donor, DD = deceased donor

20 B Barrou, EFPMO Juin 2010 HMGB1-induced TLR4-mediated inflammation Krüger et al. Blood 2009 Proximal tubular cell line (HK-2) cultured without (Unstim) or with the TLR4- specific ligand LPS (1 μg/ml) or with rHMGB1 (5 μg/ml) rHMGB1 stim

21 B Barrou, EFPMO Juin 2010 TLR2 Expression: kidney >> Leukocytes Kidney TLR-2 -/- Leukocytes TLR-2 -/- Leemans /Florquin et al. J Clin Invest. 2005

22 B Barrou, EFPMO Juin 2010 TLR4 Expression: kidney >> Leukocytes Huiling Wu et al. J Clin Invest Kidney: KO, leuco: WT Kidney: WT, leuco: KO

23 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Zhai et al. J. Immunol TLR4 dependent liver ischaemia reperfusion injury Differences between organs

24 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Principes de conservation Conserver en hypothermie : –Loi de Vant Hoff : activité enzymatique de 50% par pallier de 10°C –10 à 12 % du métabolisme persiste à 4°C Limiter lœdème intracellulaire : –Imperméants : qui « imperméabilisent » la membrane –Colloïdes : pression oncotique dans compartiment vasculaire Limiter la perte énergétique (stock en ATP) : –Composition extracellulaire des solutions Prévenir lacidose intracellulaire… mais pas trop : –Sévère : activation phospholipases, protéases –Modérée (6.9 – 7) : inhibition fructokinase glycolyse Prévenir les lésions oxydatives des radicaux libres : –Chélation ? La plupart sont produits lors de la reperfusion… Développer la préservation dynamique Immunomasquage : Théorie du signal danger (Polly Matzinger)

25 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Solution intra ou extra cellulaire ? Na+ K+ Na+ En ischémie : lésions des membranes 02 ATP Niveau ATP de lactivité des pompes

26 B Barrou, EFPMO Juin P Magnetic Resonance Spectroscopy of Isolated perfused rat kidney (37°C + continuous perfusion 95%O2 5% CO2) ATP (%) Bauza G, Hauet T, Eugene M Effect of depolarizing (high K+) solutions C Krebs - PEG 30 g/L Eurocollins U W time (h) high K+ low K+ Laboratoire de RMN - Physiologie - Cryobiologie- Michel EUGENE

27 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Comment limiter ces lésions ? Les solutions de préservation Composition extracellulaire : K+ bas –Lutter contre le spasme Gokina et al Am.J Physiol Heart Circ.Physiol 278:H2105-H2114, 2000 Effects of elevation in external K+ concentration on contractile force and membrane potential in rabbit MCA M Eugène

28 B Barrou, EFPMO Juin 2010 activité Na-K ATPase entrée passive Na+ œdème cellulaire ImperméantsColloides saccharides Glucose (monoS de PM 180) : abandonné car produisant des lactates Eurocollins Mannitol (monoS de PM 182) : propriétés anti-oxydantes Marshalls, HTK, celsior Sucrose (diS de PM 342) PBS Raffinose (triS de PM 504) UW Anions non saccharidiques Agissent au niveau interstitium et mbe Gluconate Citrate Lactobionate tous chargés négativement Agissent par propriétés électro- chimiques

29 B Barrou, EFPMO Juin 2010 activité Na-K ATPase entrée passive Na+ œdème cellulaire ImperméantsColloides Agissent au niveau du compartiment vasculaire HES (amidon) UW PM > 10 6 daltons viscosité, agrégation GR Dextran : PEG : SCOT 15, IGL1 différentes longueurs de chaine immunomasquage

30 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Lavenir : la préservation normothermique ? Eviter lhypothermie, qui a des effets délétères en elle-même Dissocier les paradoxes de la réadministration dO2 de leffet cataclysmique des leucocytes lors de la reperfusion Par une solution acellulaire capable de transporter lO2 –Restauration de la phosphorylation oxydative –Induction de mécanismes de réparations des lésions dischémie –Avant la seconde claque de la reperfusion –En dehors de toute inflammation et de toute infiltration du greffon par les leucocytes Induction de facteurs susceptibles dinduire des phénomènes de réparation cellulaire et de prévenir les lésions de reperfusion : –Hème Oxygénase I –HSP 70 –…

31 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Modèle dautotransplantation chez le chien, sans ischémie chaude initiale Brasile L, AJT 2003, 3: Place respective des différentes modalités… Viaspan, statique, 4° Mox 100, viaspan, 4° Perfusion pulsatile 32°, EMS + Hb bov + 02

32 B Barrou, EFPMO Juin 2010 Conclusion Une bonne greffe commence par une bonne préservation Lischémie froide doit rester la plus courte possible Les chirurgiens doivent connaître les lésions dIR et les différentes solutions de préservation La préservation sur machine pour les reins va concerner 1/3 à la 1/2 des greffons Nombreuses perspectives de réanimation ex vivo des greffons Laboratoires de perfusion ?


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