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Bâtiment Grégor Mendel - 43, boulevard du 11 novembre 1918 69 622–VILLEURBANNE Cedex tél : 0472431377 - fax : 0472431223 - Symbiose actinorhizienne - Symbiose.

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1 Bâtiment Grégor Mendel - 43, boulevard du 11 novembre –VILLEURBANNE Cedex tél : fax : Symbiose actinorhizienne - Symbiose mycorhizienne - Interactions rhizosphèriques - Transfert de gènes et adaptation bactérienne - Groupes fonctionnelles du cycle de lazote - Bactéries Pathogènes Opportunistes et Environnement Université Claude Bernard Lyon 1 UMR CNRS 5557 USC INRA 1193 Méthylation et métalloïdes toxiques B. Cournoyer

2 Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques plusieurs bactéries pathogènes = résistantes au tellurite et/ou sélénite: - P. syringae, Agrobacterium tumefaciens - P. aeruginosa, E. coli VTEC, Salmonella typhimurium - Staphylococcus aureus K 2 TeO 3 4ppm Odeur dail Pourquoi? Quel mécanisme? Méthylation? réduction

3 Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques Identification de la bTPMT (Cournoyer, 1996) P. syringae SmaI 12 HincII EcoRI PstI HincIIXhoI pSK - EcoRI pSK T3 T7 0 tpmE htpX-likeorfC-like E. coli TPMT-E K 2 TeO 3 4ppm E. coli ::tpmE + sélénite LB (Ranjard et al., 2000) Analyse GC-MS Odeur dail = DMTe

4 Caractérisation de la bTPMT Caractéristique du déterminant: - forte homologie avec la thiopurine méthyle transférase (TPMT) humaine (30% identités; 55% similarités) - Gmelin (1824): odorous materials obtained from Se et Te during animal experiments; a garlic-like odour (première observation) - Idem chez lHomme lors dintoxication au Se et Te

5 Krynetski & Evans, Oncogene, 2003 Métabolisme des thiopurines - Fin des années 80, la TPMT est montrée essentielle pour le métabolisme des pro-drogues « 6-mercaptopurine » et « thioguanine nucleotides » HPTR: hypoxanthine phosphoribosyltransferase Autres fonctions chez lHomme - détoxication de métalloïdes???

6 Introduction de toxiques (As, Se, Te, etc) dans lenvironnement Produits volatils observés e. g. DMSe, DMDSe, DMSSe, etc GC-MS Présence de bTPMT ?? Sol (10 g) Suite des travaux sur les bTPMT

7 Détection des gènes de la bTPMT AA AA 234 bp détection de tpm dans les ADN méta-génomiques des sols et des eaux Stratégie mise en place - élaboration dun crible PCR / utilisation des domaines conservés TPMT-E vs huTPMT (30% identités; 55% similarités) TPMT-E

8 Diversité des bTPMT Homme, Rat, Souris UbiG UNK TPMT A B C D E F G H I J K L M N P O Q R S T U V X ( et -proteobacteria) (eubacteria) bTPMT uniquement chez 30% des -proteobacteria =, Bordetella spp. - plus de 50% de similarités - plusieurs allèles par lignée * = sol (7) Publication: Favre-Bonté et al., ms en cours de rédaction *

9 kDa Avant induction Après induction Extrait soluble TPMT G1 TPMT G2 Marqueurs TPMT G3 Chromatographie d'affinité : TPMT-G : Ni-NTA (élution par 250 mM imidazole) TPMT-E : Glutathione-Sepharose-4B (élution par 10 mM glutathion) TPMT-G TPMT-E Avant AprèsTPMT-E GST M Coupure de lHis tag Affinité des bTPMT pour les métalloïdes

10 Mise au point des tests enzymatiques. tampon de réaction (selon Krynetski et al., 1995). choix du substrat – 6-mercaptopurine. Immuno-suppresseur (lors des greffes). Traitement de la leucémie, et. Maladie auto-immune TPMT 0,5 0,6 0,7 0,8 0, DO 320 Temps (min) Courbe 1 Courbe 3 Courbe 2 Courbe 4 Courbe 5 Activité de méthylation de la 6-MP 10 µM TPMT-E TPMT-ETPMT-G1TPMT- G2 TMPT- G3 V m (nmol.min -1.mg -1 )5,62,431.3 K m (µM) Paramètres cinétiques de méthylation de la 6-MP par TPMT-E et les 3-TPMT-G. huTPMT, Km= 10.6 M DO 320

11 Affinité des formes enzymatiques pour les toxiques séléniés - méthylation de substrats séléniés: 6-séléno-purine, Se-cystine, sélénite et séléniate. avec des extraits de protéines totales TPMT+ - obtention de DMSe à partir de Se-cystine - absence dactivités avec le sélénite. en cours, comparaison des affinités et vitesse de réaction entre mercaptopurine et séléno-purine SeH DO 350

12 Substrats de la méthyle transférase bTPMT CH 3 SeCH 3 bTPMT SAMSAH Autres produits: DMS, DMDS, DMDSe DMSeS, DMTe S, Se, Te – inorg. et org. bTPMT Thiopurine (anti-métabolites de la synthèse des purines) - utilisation répandue pour le traitement de maladies auto-immunitaires, de la leucémie, du cancer et prévention des rejets dorganes transplantés

13 bTPMT et lAs? La piste des odeurs -Bartolomeo Gosio (1892): obtained a garlic like odor from microbes growing on a potato mash containing arsenic trioxide + Scopulariopsis brevicaulis (Gosios fungi): Gosios garlic-like gas (TMA) from As mercaptan-like odour (DMSe) from selenite garlic-like odour (DMTe) from tellurite

14 Méthylation bactérienne de lAs (en aérobiose) Etat des lieux: - E. coli + DMA = TMAO (trimethylarsine oxide) - Nocardia + MMA = (CH3)nAsH3-n (les méthyle arsines) Bactéries TPMT +: - Pseudomonas sp. + arséniate = (CH3)2AsH - Aeromonas et Alcaligenes + méthyle arsoniate (MMA)= (CH3)AsH2 et (CH3)2AsH As dans lenvironnement Produits volatils observés - MeAs, DMeAs, TMeAs « There are apparently no accounts of the characterization of specific arsenic methyltransferases from microorganisms » (Bentley and Chasteen, 2002)

15 Autres As métalloïdes-méthyle transférases ? Les pistes: 1. Les proches voisins de la TPMT - UbiG (demethylubiquinone methyltransferase) - « UNK » (putative methyltransferases) 2. Les UbiE et MMT (métalloïdes méthyle transférases) - Découverte simultanée – nouvelle famille de Se/Te-méthyltransférases UbiE - Ensemble des eubacteries MMT - large distribution - plusieurs duplications - synthèse de métabolites secondaires dont certains antibiotiques et certaines molécules anti-cancéreuses - présence dans les eaux pas Se-méthylation Se-méthylation Ranjard et al., 2004

16 Conclusions: 1.Plusieurs observations laissent entrevoir un rôle de la TPMT dans la méthylation de lAs 2.Les formes méthylées de lAs sont obtenues dans les conditions dexpression de la TPMT ou chez des organismes TPMT+ 3. Dautres méthyle transférases pourraient jouer un rôle: UbiG, certaines methyle transférases putatives, …et MMT Même famille - plusieurs lignées (23) chez les -protéobactéries - structures différentes - substrats différents?

17 Perspectives Voies de méthylation de lAs - Recrutement dun étudiant M2 e. g.. les formes de bTPMT et la méthylation de substrats arséniés. Analyse comparative des affinités pour les substrats « S », « Se », « Te » et « As » * Recherche partenaire au sein du GDR-As (co-encadrement du M2) pour le volet chimie analytique (détection/caractérisation des formes méthylées)

18 Bactéries Pathogènes Opportunistes et Environnement Remerciements: - ToxNuc-Environnement - CNRS – UCBL - ENVL - Région Rhône-Alpes Participants: L. Champier S. Favre-Bonté L. Ranjard C. Prigent- Combaret + qqes stagiaires C. Monnez E. Brothier S. Favre-Bonté S. Nazaret B. Cournoyer

19 Méthylation de lAs arsenate arsenite Methyl- arsonate Methyl- arsonite Dimethyl- arsinate Dimethyl- arsinite Trimethyl- arsine oxide (TMAO) Trimethyl- Arsine (TMA) Excrété dans les urines (According to Challenger (1951)) (selon Cullen et Bentley, 2005) AsH 3, Inorganic forms of arsenic are more toxic than organic forms - Trivalent forms are more toxic than pentavalent AsH3 gaz, As(-III) > As(III) > As (V) > composés méthylés MeAsDMeAs ++ (?)


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