de nouvelles activités enzymatiques

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1 de nouvelles activités enzymatiques
Peut-on créer de nouvelles activités enzymatiques

2 Chemicals manufacture Textiles, leather and fur
INDUSTRIAL ENZYMES: WORLDWIDE MARKET FORECAST, ($Million) 4.0 1,820.3 1,557.0 1,498.0 Total 2.7 67.6 60.8 59.2 Chemicals manufacture 6.9 136.0 104.3 97.6 Pulp and paper 2.0 182.7 164.2 161.0 Textiles, leather and fur 4.8 600.9 498.0 475.2 Detergents/cleaners 3.5 833.1 729.7 705.0 Food and animal feed AAGR% 2002 1998 1997 Market Sector

3 Utilisation des enzymes recombinantes dans l’industrie alimentaire
enhances rising of bread dough bacteria or fungi xylanase (hemicellulase) converts starch to simple sugars bacteria pullulanase improves bread dough structure protease improves fruit juice clarity fungi pectinesterase slows staling of breads maltogenic amylase oil and fat modification lipase reduces food deterioration, particularly egg-based products glucose oxidase converts glucose sugar to fructose sugar glucose isomerase improves beer filtration beta-glucanase starch/sugar modification cyclodextrin-glucosyl transferase clots milk protein to make cheese chymosin catalase alpha-amylase removes bitter substances from beer alpha-acetolactate decarboxylase Use (examples) GE Organism Enzyme Name

4 Les technologies industrielles d’aujourd’hui (synthèse chimique, transformation de produits naturels) utilisent de plus en plus des procédés biologiques. L’amélioration d’un procédé de biotransformation demande une amélioration des enzymes qui le compose. Mais peut-on modifier (tout en les contrôlant) les propriétés biochimiques des enzymes?

5 Analyse des relations structure-fonctions des protéines
Comprendre comment le repliement d’une protéine engendre sa fonction de catalyseur Comprendre les interactions à moyenne et longue distance pour calculer et prédire le repliement (difficile!)

6 Les solutions (1) Déterminer la structure tridimensionnelle (RX, RMN, autres) Modéliser la protéine (calcul) Introduire les mutations Exprimer, purifier, etc Dans de nombreux cas la (ou les) mutations a (ont) des effets non prévus

7 Méthode longue, coûteuse et sans garantie de résultats
Les solutions (2) Utiliser la biodiversité naturelle pour trouver des propriétés enzymatiques nouvelles (substrats, pH, T, P, cofacteurs, etc) Méthode longue, coûteuse et sans garantie de résultats Les propriétés attendues peuvent être disjointes!!

8 Méthode alternative? Qui ne nécessite pas forcément de connaître la structure tridimensionnelle de l’enzyme Qui ne se focalise pas sur une partie fine de la protéine Qui intègre l’ensemble de la séquence protéique dans la détermination d’une fonction Qui pourrait mettre en évidence l’ensemble des structures primaires qui permettent la construction d’une fonction (repliement, substrat, dynamique, etc)

9 L’évolution est lente, elle a besoin de nombreux cycles successifs de diversification et de spécialisation, pour sélectionner une fonction nouvelle. mutagénèse recombinaison crossing-overs reproduction sexuée Génétique substrat réaction cofacteur environnement (pH, T, P) Biochimique

10 Evolution naturelle Cycles successifs de
Modification du matériel génétique Sélection des fonctions nouvelles

11 Sequence recombination
biodiversity natural Single gene Gene family Sequence recombination (DNA shuffling) Random mutagenesis Segment directed biodiversity artificial Function space analysis Functional selection Optimized enzyme Expression Fonctional biodiversity

12 La recombinaison augmente la vitesse de l’évolution.
Générer la diversité La recombinaison augmente la vitesse de l’évolution.

13 L’évolution combinatoire consiste donc à reproduire l’évolution naturelle avec un seul impératif: ramener quelques million d’années à quelques jours ! Elle est composée comme l’évolution naturelle de cycles de modification du matériel génétique et de sélection de l’information.

14 Générer la diversité Mutagénèse DNA shuffling Step Itchy Shiprec
Scratchy Rachitt Clery L-shuffling Dogs RmPCR Réparation hétéroduplex

15 Générer la diversité Générer la diversité est la première étape de l’évolution combinatoire. Cette étape dicte le devenir de l’expérience, car c’est de notre aptitude à générer la diversité que l’on pourra chercher des évènements originaux.

16 Générer la diversité Un peu de théorie: Pour envisager toutes les combinaisons possibles sur un protéine de 500 aa, il faut combinaisons possibles, soit clones et donc ADNs différents! Le calcul inverse montre qu’avec clones, on ne peut muter que 5 positions!

17 Nombre d’acides aminés changés simultanément
Générer la diversité 2x1021 107x109 7 4x1018 9,8x109 6 6x1015 5 8,4x1012 651605 4 9x109 823080 68590 3 16245 14440 2 3800 190 95 1 Nombre d’acides aminés changés simultanément (M) 20 10 Nombre de positions mutées (N)

18 Mutagenèse Error-prone PCR Souches mutatrices
Générer la diversité Mutagenèse Error-prone PCR polymérases non fidèles variation de [Mg2+] abaissement de la concentration d’un nucléotide Souches mutatrices inactivées dans les systèmes de réparation de l’ADN, elles produisent des plasmides comportant des mutations

19 Local sequence degeneration
CYP101 L A G L P E D - - CYP108 A L G V P E E - - CYP102 G F - - N Y R F N S F Y R D Q P H P F I E helix E-F loop F helix CYP1A1 202 C F - - G R R Y D H N H Q E - - L L S L- CYP1A2 204 C F - - G Q H F P E S S D E - - M L S L- * * * * * * * * *

20 Sequence changes compared to parent
Saturated segment directed mutagenesis in a 1500 bp long sequence 1A1 CTTTGGCCGGCGCTATGACCACAACCACCAAGAACTGCTTAGCCTAATCA-3’ T T G.. A..A..T.CC.G.G.G.AG.G.C...A A.....T..CT......AG...C...T T.C.T….....AG.G.....T T...TG.G C...T C.T....G..G.G.C...T X..T...T......A....C...T A..A......T....G......C...T A.....T.C.TG.....AG...C...T A....CCTG...G T T...T......A....C T...TG.G C...T A.....T...T C...T A..A....CCT G.C...T A.....T.CCT....G.AG T A..A..T.CCTG G.C...T A..A..T.CCTG.G....G...C...T A..A..T.C.TG G.C...T A..A..T...T....G.A....C...T A..A..T.C.TG...G T A CCT....G......C...T T..CT G T T.CCT....G..G...C...T A..A..T.CCT..G....G A..A..T..CTG.G C...T Degenerated primer used for PCR Sequence changes compared to parent in functionally competent mutants

21 In vitro PCR In vivo Generation of segment targeted biodiversity by
recombination PCR Degenerated long primer In vitro In vivo Segment targeted library of protein variants

22 DNA shuffling Générer la diversité
gène ancestral La première méthode, décrite par Stemmer en Il faut des gènes assez homologues pour que le shuffling se fasse. évolution naturelle pool de fragments fragmentation réassemblage

23 Unique yeast recombination properties
Homologous gap repair Identical sequences Single plasmid homeologous recombination Similar sequences Gap repair by homeologous recombination

24 Functionally competent interspecies and interfamily
P450 1A1 P450 1A2 Mouse Rabbit Mouse Functionally competent interspecies and interfamily chimeric P450s obtained only by in vivo recombination in yeast (no PCR step)

25 Controlled DNAse I digestion
In vitro generation of sequence diversity Controlled DNAse I digestion Gene fragments PCR or ligation Shuffled library Gene familly or primary mutants vector Amplification of full length products Cloning DNA shuffling Error prone PCR with primers vector Cloning

26 STaggered Extension Process
Générer la diversité Step STaggered Extension Process Méthode qui utilise les propriétés des polymérases thermostables, nécessite de l’homologie entre les fragments

27 Rachitt Générer la diversité
Random CHImeragenesis on Transient Templates Méthode un peu différentes des autres puisqu’elle ne fait pas appel au réassemblage par des polymérases, mais il faut toujours de l’homologie entre les fragments

28 Générer la diversité L-shuffling

29 (Incremential Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes)
Générer la diversité Itchy (Incremential Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes) Méthode qui ne tient pas compte de l’homologie entre les parents, ni de la phase de lecture des gènes NATURE BIOTECHNOLOGY VOL 17 DECEMBER 1999

30 Réparation hétéroduplex
Générer la diversité Réparation hétéroduplex

31 Controlled DNAse I digestion Size selection of partial
CLEARY shuffling method Controlled DNAse I digestion bases fragments Long range PCR without primers promoter ORF terminator Yeast -E. coli shuttle vector 11kbp Gene family PCR selection of full length cDNAs * Size selection of partial & full length cDNAs Mutagenesis In vivo recombination “clean” vector Library of mosaics

32 in vitro + in vivo = more diversity + self-cloning

33 Example of mosaic P450 sequences following shuffling
of human CYP1A family by the CLEARY procedure. P450 1A1 tags P450 1A2 tags Common zone Single point Mutation.

34 Sélectionner les variants
In vitro Ribosome display Phage display Microencapsulation In vivo Yeast display Cribles fonctionnels Cell sorting, FRET, High- Troughput Screening

35 hat ou et s hat ou creened or!
Sélectionner les variants Méthodes in vitro La sélection C’est une étape critique Elle doit être ajustée finement hat ou et s hat ou creened or!

36 Sélectionner les variants
Méthodes in vitro Ribosome display

37 Sélectionner les variants
Méthodes in vitro Microencapsulation

38 Sélectionner les variants
Méthodes in vitro Phage display

39 Sélectionner les variants
Méthodes in vivo Yeast surface display

40 Sélectionner les variants
Méthodes in vivo Cell-sorting FRET

41 Sélectionner les variants
Méthodes in vivo Crible fonctionnel C’est le crible le plus simple à mettre en œuvre: Il permet de trier un très grand nombre de cellules (entre 1x105 et 1x107 cellules par cycle) Le lien entre l’ADN et le phénotype est conservé L’activité est directement testable par: la résistance (antibiotique, etc) la prototrophie (vitamine, acide aminé, etc) l’activité de transformation : d’un susbstrat en produit coloré ou fluorescent d’un susbstrat toxique en un produit innofensif d’un susbstrat innofensif en un produit toxique

42 Sélection sur l’activité
Sélectionner les variants Méthodes in vivo Sélection sur l’activité

43 Sélection sur l’activité
Sélectionner les variants Méthodes in vivo Sélection sur l’activité

44 Un exemple d’évolution combinatoire:

45 Diversité générée par Error- Prone PCR et DNA shuffling
Screening de l’activité directement sur cellules en présence du substrat

46 Cartographie des mutations obtenues: aurait- on pu les prédire?
Une bonne diversité Cartographie des mutations obtenues: aurait- on pu les prédire?

47 Conclusions L’évolution combinatoire est une méthode nouvelle dont les applications industrielles sont importantes. Il existe plusieurs enzymes issues de ces techniques qui sont déjà commercialisées. Il y a plusieurs sociétés de biotechnologies dont l’activité principale est la recherche de biodiversité sous toutes ces formes: Maxygen, Diversa, Genencore, Novozyme, Enchira, Proteus etc. Les secteurs d’activité de la santé sont aussi impliqués, avec la fabrication de vaccins, d’anticorps monoclonaux.

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