TP 10 Enzymes immobilisées titre.

Présentation au sujet: "TP 10 Enzymes immobilisées titre."— Transcription de la présentation:

1 TP 10 Enzymes immobilisées titre

2 1. Préparatifs. La lumière s’éteint dans la salle de briefing. Un hologramme de la planète géante apparaît. Pour une fois, hommes et femmes sont réunis ensemble pour écouter l’exposé de Ripley. 2.1

3 1. Préparatifs. -- On peut y aller ? OK. Maintenant que nous sommes en orbite autour de Jupiter, nous allons pouvoir commencer l’exploration directe proprement-dite. L’objectif étant de ramener sur Terre des échantillons de l’atmosphère Jovienne et, si possible, mettre en évidence la présence de vie. -- Qu’est-ce que tu veux qu’il vive dans cette grosse boule de gaz, demande John narquois. La pression et la température atteignent des valeurs titanesques. -- Des modèles spéculent qu’il pourrait exister une forme de vie évoluant dans les couches externes. Elle se déplacerait comme des ballons libres ou des dirigeables. -- Elles auraient l’aspect de gigantesques méduses. -- C’est une blague, surenchérit John ! On nous envoie à la pêche à la méduse ! C’est encore une idée de nana ! -- Les idées de mecs brillent par leur absence, envoie Eva. -- Rappelle-moi, Eva, tu es un mec ou une nana ? -- John, si tu ne te tais pas, gronde Ron, tu finis ton séjour dehors ! 2.1

4 1. Préparatifs. -- Ripley, explique comment nous allons chercher ces échantillons, intervient Bruce pour calmer les esprits. -- Merci, Bruce. Nous disposons d’un drone Jovien. Il est stocké dans la soute depuis notre départ. Bruce et moi sommes en train de finir les simulations. Il est en parfait état de marche. -- Un drone est un appareil automatique, remarque Mélanie. -- Dans notre cas, le drone, appelé Pégase, possède un ordinateur de bord qui lui donne une grande autonomie et des capacités d’adaptation aux conditions de vol. Cependant, le vol sera contrôlé à distance, à partir du Junon par un pilote, en l’occurrence Bruce ou moi. Descendons à la soute, je vais vous montrer. 2.1

5 1. Préparatifs. Bruce se met à la console. L’appareil commence à bourdonner. -- Tout les senseurs sont opérationnels. Pégase est à même de mesurer les paramètres physiques de son environnement. Il contient dans sa carlingue un mini-laboratoire chimique pour établir la composition des gaz de l’enveloppe externe. Il sera capable, dans un deuxième temps, de plonger dans la couche hydrogène hélium qui se situe en-dessous de 10 000 km de profondeur. 2.1

6 2.1 1. Préparatifs. -- Comment sera-t-il piloté, demande Body ?
Ripley se rend près d’un caisson vertical posé contre la cloison. Elle l’ouvre comme un sarcophage. -- Voici un « cocon » de pilotage. Le pilote s’installe à l’intérieur et enfile le casque de vision virtuelle. Ripley fait la démonstration. -- L’espace est très confiné et la température s’élève rapidement au-dessus de cinquante degré. C’est pourquoi nous sommes deux, Brice et moi, à nous relayer. Les informations de vol sont envoyées par Pégase et traitées par l’ordinateur avant de nous parvenir au niveau du casque, mais aussi des bras et des jambes qui contrôlent le vol. 2.1

7 1. Préparatifs. -- Mais pour la détection de trace de vie, insiste Mélanie ? -- Ca, c’est le domaine d’Angie. -- Tu vois la boule sous le nez de l’appareil ? C’est le biocapteur. C'est un dispositif permettant de détecter de façon spécifique, une molécule précise et de la doser de façon quantitative. Il est constitué de trois parties: - le biorécepteur, constitué d'une enzyme et de son support - le transducteur, qui transforme le signal chimique en signal électrique - l'amplificateur, qui permet la lecture du signal électrique par l'appareillage. 2.1

8 1. Préparatifs. Plutôt que de tenter de repérer une créature vivante dont nous ignorons tout de l’aspect, nous allons rechercher des molécules organiques provenant d’un métabolisme cellulaire classique. Le biocapteur de Pégase est conçu pour reconnaître le saccharose. L'enzyme utilisée pour la reconnaissance est l'invertase. Les conditions environnementales ne permettent pas d'utiliser une enzyme libre en solution Celle-ci se décomposerait en quelques instants. C'est pourquoi il faut préparer l'invertase sous forme immobilisée. Plusieurs techniques sont possibles. Nous allons tester deux d'entre elles. 2.1 Inclusion dans l’alginate. Adsorbtion sur DEAE sépharose Ces méthodes sont comparées à un témoin d’enzyme libre.

9 C = m/M x 1/V -----> m = C x M x V
2. Gamme d'étalonnage du sucre inverti. Cette partie permet de convertir l'activité des différentes préparations d’abs.mn-1 en mol.L-1.mn-1 2.1. Préparation de la solution mère. Préparer par pesée, 200 mL d'une solution de concentration 10 mmol.L-1 d'un mélange égal de glucose et de fructose. C = m/M x 1/V -----> m = C x M x V 2.1 m = 0,01 x 180 x 0,2 = 0,360 g mglu = C =(mglu + mfru) /180 x 1/0,2 x 1000 = mmol.L-1 mfru =

10 Ctube = Cmère x Vmère / Vtot
2. Gamme d'étalonnage du sucre inverti. Cette partie permet de convertir l'activité des différentes préparations d’abs.mn-1 en mol.L-1.mn-1 2.2. Préparation et dosage de la gamme. Préparer une série de tubes en suivant les consignes du tableau suivant. 1 2 3 4 5 6 Vol sol mère 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Vol eau distillée 1,8 1,6 1,4 Vol Tp pH 4,7 DNS C après DNS (en mmol.L-1) 2,4 1 2 3 4 5 6 Vol sol mère 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Vol eau distillée Vol Tp pH 4,7 DNS 2.2 Ctube = Cmère x Vmère / Vtot Vtot = 3 mL avant DNS Vtot = 5 mL après DNS

11 2.2 2. Gamme d'étalonnage du sucre inverti.
Cette partie permet de convertir l'activité des différentes préparations d’abs.mn-1 en mol.L-1.mn-1 2.2. Préparation et dosage de la gamme. Dosage 1 2 3 4 5 6 Vol sol mère 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Vol eau distillée 1,8 1,6 1,4 Vol Tp pH 4,7 DNS C après DNS (en mmol.L-1) 2,4 Abs 0,084 0,224 0,375 0,530 0,667 0,892 1 2 3 4 5 6 Vol sol mère 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Vol eau distillée 1,8 1,6 1,4 Vol Tp pH 4,7 DNS C après DNS (en mmol.L-1) 2,4 2.2 C = (Abs-b) / a La droite est correcte sans plus ! L’absorbance est obtenue après 5 minutes d’incubation. On peut en déduire que: Vexp = (Abs – b) / a en mmol.L-1 .(5mn)-1 La droite ne passe pas par 0 C’est normal !

12 Actlib = Actexp / Dt x 1/D x Vtot/VEz
3. Dosage de l’enzyme libre. Ez - Verser dans un tube: - 0,25 mL d'invertase diluée au 1/? (dans du Tp 4,7). - 0,5 mL de saccharose (C = 1,2 mol.L-1) - 2,5 mL de Tp 4,7 - Incuber 5 mn à 40°C -----> agiter régulièrement. - Verser 2 mL de DNS dans la solution - Le porter à 100°C pendant 5 mn exactement - Refroidir. - Ajouter 15 mL d'eau distillée. - Lire l'absorbance à 530 nm. -----> si l'absorbance n'est pas adaptée à un dosage précis, changer la dilution. Act Ez Dilution D Ez diluée 3. Vez = 0,25 mL Ez Vtot = 5,25 mL Actexp = (Abs – b) / a Actlib = Actexp / Dt x 1/D x Vtot/VEz Abs par min pour l’Ez pure Actlib = Actexp x 4,2 x 1/D par mL d’Ez

13 4.1 4. Inclusion dans l’alginate.
La voix du commandant retentit dans le haut parleur du laboratoire. -- Le ministère de l’expansion de la foi veut une photo des responsables de la mission Pégase. -- Tu es sûr ? Il s’agit de Ripley, Eva et moi. Nous ne sommes pas en odeur de sainteté. -- Le parti veut démontrer qu’il défend la cause des femmes en leur permettant d’accéder à des postes de responsabilité. -- Si nous sommes ici, c’est grâce au régime précédent qui était laïc ! -- Je sais, ce n’est qu’une question politique. Et puis les ordres sont les ordres. Rendez-vous près du drone dans une demi-heure pour la séance photo. Préviens les deux autres et exécution ! Angie explique la situation à ses deux amies. Ripley est furieuse. -- Ces Enfoirées nous ont condamnées au camp de redressement et nous devrions faire les guignols pour leur image de marque ? -- C’est peut-être un moyen pour rentrer en grâce. -- On ne peut pas faire confiance à des fanatiques ! Ils n’ont aucune morale. Ce qui compte c’est la diffusion de leur idéologie, qu’importent les individus. Ils nous crucifieraient sans scrupules. 4.1

14 4.1 4. Inclusion dans l’alginate.
-- Je crois que j’ai une idée, dit Eva avec l’œil pétillant. Ils veulent une photo, ils ne vont pas être déçus. J’ai cousu deux trois petites choses spéciales filles. Eva sort trois tenues de son caisson de rangement. -- Je ne peux pas mettre ça, s’indigne Ripley. J’ai horreur des robes. Et tu as vu la longueur de celles-ci ? C’est une véritable provocation. Angie enfile le vêtement sans se faire prier. -- Les amazones sont toujours prêtes à se battre. Pense qu’à l’époque, les femens étaient encore moins vêtues ! -- C’est qui ces femens ? Ce sont les habitants de Dune ? 4.1 Qui sont les femens? A qui Eva fait-elle allusion avec les habitants de Dune ?

15 4.1 4. Inclusion dans l’alginate. 4.1. Principe. Ez Ez Ez Ez S Ez Ez P
A quel point cette technique est-elle efficace ? 4.1. Principe. Un mélange de solution enzymatique et d'alginate de sodium est déposé goutte à goutte dans une solution de CaCl2. En présence de calcium, l'alginate forme un gel (ce qui se traduit par la formation de billes) emprisonnant l'enzyme dans ses mailles. Ces billes sont stables en absence d'agents complexant du calcium. 4.1 Ez partiellement relarguée. Ez Ez Ez partiellement incluse. Ez Ez S Ez Ez Ez partiellement inefficace. P

16 On néglige le volume des billes.
4. Inclusion dans l’alginate. Ez diluée 4.3. Détermination de l'activité immobilisée. 4.2. Inclusion dans l'alginate. VEz = 0,5 mL Ez - Verser dans un tube: - 8 billes - 0,5 mL de saccharose (C = 1,2 mol.L-1) - 2,5 mL de Tp 4,7 - Incuber 5 mn à 40°C -----> agiter régulièrement. - Verser 2 mL de DNS dans la solution - Le porter à 100°C pendant 5 mn exactement - Refroidir. - Ajouter 15 mL d'eau distillée. - Lire l'absorbance à 530 nm. - Mélanger: - 0,5 mL d'invertase diluée au 1/? dans du Tp 4,7 - 2,5 mL d'alginate à 2% - Laisser tomber goutte à goutte le mélange, d'une hauteur de 20 cm environ, avec une pipette de 10 mL dans 100 mL d'une solution de CaCl2 (C = 0,15 mol.L-1) légèrement agitée. -----> Utiliser un Bécher de 250 mL par exemple. - Laisser séjourner les billes 30 minutes dans le CaCl2. - Les rincer à l'eau distillée. - Les égoutter. - Compter le nombre de billes obtenues. + arginate Varg n’intervient pas dans les calculs car la totalité est versé dans le CaCl2. 4.2 % Ez utilisée = 8 / N VCaCl2 = 50 mL Abs N billes Vtot = 5,0 mL 4.4. Détermination de l'activité résiduelle. On néglige le volume des billes. Effectuer le même dosage en utilisant 0,25 mL de solution de CaCl2. Vtot = 5,25 mL Abs Vrés = 0,25 mL

17 Actimm = Actexp / Dt x N/8 x Vtot/VEz x 1 / D
4. Inclusion dans l’alginate. Ez diluée 4.3. Détermination de l'activité immobilisée. VEz = 0,5 mL Ez Actexp = (Abs – b) / a + arginate Varg n’intervient pas dans les calculs car la totalité est versé dans le CaCl2. Une partie (8 / N) seulement des 0,5 mL d’enzyme diluée a été dosée par le DNS (V = 5 mL) 4.3 Actimm = Actexp / Dt x N/8 x Vtot/VEz x 1 / D % Ez utilisée = 8 / N par min par mL d’Ez pour l’Ez pure Actimm = Actexp 0,25 x N x 1 / D Abs N billes Vtot = 5,0 mL 4.4. Détermination de l'activité résiduelle.

18 4.4 4. Inclusion dans l’alginate.
Ez diluée 4.3. Détermination de l'activité immobilisée. VEz = 0,5 mL Ez Actexp = (Abs – b) / a + arginate Varg n’intervient pas dans les calculs car la totalité est versé dans le CaCl2. 4.4 Actimm = Actexp / Dt x N/8 x Vtot/VEz x 1 / D Actimm = Actexp 0,25 x N x 1 / D 4.4. Détermination de l'activité résiduelle. Les 0,5 mL d’enzyme sont dilués: par le CaCl2 (d1 = 0,5 / 50) par le DNS (d2 = 0,25 / 5,25) Vtot = 5,25 mL Abs Actrés = Actexp / Dt x 1/d1 x 1/d2 x 1/D x 1/VEz Vrés = 0,25 mL Actrés = Actexp x 840 / D

19 5.1 5. Immobilisation par adsorption ionique sur DEAE-Cellulose.
5.1. Principe. A pH 7, l'invertase dont le pHi est de 4,5, est chargée négativement et peut être adsorbée sur un support chargé positivement, le DEAE-Cellulose. 5.1 - - - - - - - - DEAE - - - - - - - - - - - -

20 5.2 5. Immobilisation par adsorption ionique sur DEAE-Cellulose.
Ez diluée VEz = 1 mL Ez 5.2. Adsorbtion. + DEAE - Verser dans un tube: - 1 ml d'invertase - 10 mL (100 mg ds Tp) de DEAE-Cellulose - Mélanger doucement (par retournement). Laisser reposer 30 mn à température ambiante, en mélangeant toutes les 10 minutes. - Centrifuger 10 mn à rpm VDEAE = 10 mL centrifugation 5.2 VTp7 = 10 mL

21 5.3 5. Immobilisation par adsorption ionique sur DEAE-Cellulose.
Ez diluée VEz = 1 mL Ez 5.3. Dosage. + DEAE VDEAE = 10 mL - Récupérer le surnageant -----> mesurer son volume. - Remettre en suspension le culot dans 10 mL de Tp 7 - Noter le volume total. - Verser dans un tube à essai: - 0,1 mL de culot remis en suspension ou de surnageant. - 0,5 mL de saccharose (1,2 mol.L-1) - 2,4 mL de Tp 4,7 - Incuber 5 mn à 40°C en agitant régulièrement. - Verser le liquide dans un tube contenant 2 mL de DNS - Le porter à 100°C pendant 5 mn exactement - Refroidir. - Ajouter 15 mL d'eau distillée. - Lire les absorbances à 530 nm. Respecter la valeur de pH du tampon. centrifugation 5.3 VTp7 = 10 mL VSgt V = 0,1 mL V = 0,1 mL Abs Abs Vtot = 5 mL Vtot = 5 mL

22 = Actexp / Dt x 1/d1 x 1/d2 x 1/D x 1/VEz
5. Immobilisation par adsorption ionique sur DEAE-Cellulose. Ez diluée VEz = 1 mL Ez 5.3. Dosage. + DEAE Activité des billes de DEAE. VDEAE = 10 mL Actexp = (Abs – b) / a centrifugation 5.3.1 Les 1 mL d’échantillon sont dilués: par le Tp7 ( d1 = 0,1 / 10 ) par le DNS ( d2 = 0,1 / 5 ) VTp7 = 10 mL ActDEAE = Actexp / Dt x 1/d1 x 1/d2 x 1/D x 1/VEz ActDEAE = Actexp x 500 x 1/D V = 0,1 mL Abs Vtot = 5 mL

23 = Vexp / Dt x VSgt x 1/d2 x 1/D x 1/VEz
5. Immobilisation par adsorption ionique sur DEAE-Cellulose. Ez diluée VEz = 1 mL Ez 5.3. Dosage. + DEAE Activité du surnageant. VDEAE = 10 mL Vexp = (Abs – b) / a centrifugation 5.3.2 VSgt Les 1 mL d’échantillon sont dilués: par le Tp7 (d1 = 1 / VSgt) par le DNS (d2 = 0,1 / 5,1) VDEAE = Vexp / Dt x VSgt x 1/d2 x 1/D x 1/VEz V = 0,1 mL Abs VDEAE = Vexp x 51 x VSgt x 1/D Vtot = 5 mL