Techniques immunologiques Plan du cours

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1 Techniques immunologiques Plan du cours
A) Propriétés du complexe anticorps/antigène Immunodiffusion Ouchterlouny et Immuno-electrophorèse Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble: ELISA et Westernblot "Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux (Facs) IgE: RIST et RAST Détection de complexes immuns: test au C1q B) Propriétés du complément CH50 C) Réponses lymphocytaires Test de lymphoprolifération aux mitogènes Test de culture mixte

2 A) anticorps/antigène
Immunodiffusion anticorps + antigène +++ anticorps++ antigène ++ anticorps+++ antigène + équivalence Ac polyclonal Ac monoclonal Précipitation

3 A) anticorps/antigène
Immunodiffusion anticorps+antigène précipitation Visalisation sur gel (bleu de comassie) Ouchterlony Immunoélectophorèse

4 Ouchterlony Sensibilité: 20-200µg/ml Équivalence: précipité bleu

5 Ouchterlony Intérêt surtout historique (savoir que c’est une technique basée sur la diffusion et la précipitation mais les détails ne sont pas matière d’examen) Permet la comparaison directe de différents antigènes (par exemple les déterminants antigéniques de l’albumine de deux espèces voisines sont-ils différents ou partiellement semblables?)

6 Ouchterlony Un puits central dans lequel on introduit les anticorps (aussi appelés antisérum) Des puits périphériques équidistants dans lesquels on introduit les antigènes à évaluer Si une seule protéine (ou un seul polysaccharide) est reconnu par l’antisérum : 1 bande; si deux protéines de PM différents sont reconnues : 2 bandes La bande la plus proche du puits central correspond à l’antigène qui a migré le plus vite (qui est donc le plus petit)

7 Ouchterlony Si on dépose des préparation différentes dans les puits périphériques, on compare les courbes de précipitation en regard de chaque puits périphérique Lorsqu’on dépose la même protéine (ou le même polysaccharide) dans deux puits adjacents, les traits de précipitation vont se rejoindre : c’est la réaction d’identité

8 Ouchterlony Si deux protéines (ou polysaccharides) différents mais partageant un déterminant antigénique sont introduites dans deux puits périphériques adjacents, les traits de précipitation fusionnent mais on note une projection qui prolonge le précipité formé par la réaction principale : cette projection est due à des anticorps qui reconnaissent des déterminants antigéniques qui ne sont pas présents dans les deux solutions : c’est la réaction d’identité partielle

9 Quizz: Ouchterlony -g chains - l chains - F(ab) - k chains
- Fc from IgG with k chains - A mixture of g heavy and k chains -g chains

10 Réponses au Quizz (just for the fun)
1 Fab : identité partielle avec 2 2. Chaînes g Identité avec ligne externe de 3 3. Mélange de chaînes g et de chaînes légères k deux bandes distinctes car les protéines ont des PM différents et ne diffusent pas de la même façon La ligne la plus proche du puits central : k (identité avec 4) L’autre ligne : la protéine la plus lourde g 4. Chaînes k Absence d’identité avec 5 Réaction d’identité avec une des protéines 3 5. Chaînes l Reconnaissance mais absence d’identité avec 4 6. Portion Fc d’une IgG possédant des chaînes k Aucune reconnaissance (pas de bande)

11 Quizz: Ouchterlony

12 Immunoélectrophorèse
A) anticorps/antigène Immunodiffusion Immunoélectrophorèse Mélange d'antigènes trop complexe (beaucoup de molécules de poids moléculaires très voisins) Séparation des Ag selon leur charge avant d’être détecter par précipitation

13 Immunoélectrophorèse
Puits contenant la mixture d'Ag Déplacement des ≠ Ag Diffusion des Ac Technique qualitative peu sensible (>100µg/ml)

14 Immunoélectrophorèse
Utilisation: Sérum (IEP-sérum) ou urine (IEP-urine) Immunoglobulines Albumine Transferrine Détection Immunoglobulines Détection d’immunodéficience: faible quantité d’un ou plusieurs isotypes Polyclonal ou monoclonal

15 A) anticorps/antigène
Immunodétection IgM IgG Radioactif Enzyme/Chromogène Fluorescence

16 A) anticorps/antigène
Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble ELISA Westernblot Sérum Urine Surnageant de culture Etc.

17 enzyme-linked immunosorbent assay
A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay Enzyme/Chromogène

18 Exemple: détection d'Ac anti-HIV
ELISA Exemple: détection d'Ac anti-HIV Résultat Sensibilité: pg/ml

19 ELISA Détection Ac ELISA sandwich Détection Ag Ac de capture

20 A) anticorps/antigène
Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble Westernblot Séparation des ≠ Ag par électrophorèse sur gel Détection par Ac (présent dans le sérum du patient) Détection de Ac par un Ac marqué Exemple: détection des faux positifs HIV (détecté par Elisa)

21 Exemple: détection d'Ac anti-HIV
Westernblot Exemple: détection d'Ac anti-HIV Résultat Protéines HIV Patient A: négatif Patient B: indéterminé Patient C: positif Pos Neg patients

22 "Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux
A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux Immunohistochimie Cytométrie en flux (FACS)

23 "Ag" liés aux cellules : sur coupe
A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Principe indirecte directe

24 A) anticorps/antigène
Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: marquage actine, tubuline et noyau

25 Maladie de Goodpasture (dépôts linéaires d’IgG et de C3b)

26 A) anticorps/antigène
Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: infiltration CD4 dans une tumeur Nég Pos

27 "Ag" liés aux cellules : sur coupe
A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: marquage Fas Pos Nég

28 A) anticorps/antigène
Immunodétection Présence d'anticorps "anti-soi" Anticorps anti-nucléaire Sérum patient Cellules test

29 A) anticorps/antigène
Immunodétection Présence d'anticorps "anti-soi" Anticorps anti-nucléaire

30 A) anticorps/antigène
Immunodétection "Ag" liés aux cellules en flux Cytométrie en flux FACS = fluorescence activated cell sorter

31 Cytométrie en flux (FACS)
A) anticorps/antigène Immunodétection Cytométrie en flux (FACS) Principe directe indirecte

32 FACS 3000 cellules/sec

33 FACS Sang "granulosité" Taille

34 FACS Sang Th Fluorescence orange Tc Fluorescence verte

35 Avantages et inconvénients
Facs versus coupe FACS: Rapidité d'analyse Multi-couleurs Possibilité de tri Coupe: Localisation Interaction entre ≠ cellules

36 A) anticorps/antigène
Immunodétection IgE: RIST et RAST Atopie

37 A) anticorps/antigène
Immunodétection IgE: RIST RIST = radioimmunosorbent test quantification des IgE totales

38 A) anticorps/antigène
Immunodétection RIST = quantification des IgE totales

39 A) anticorps/antigène
Immunodétection IgE: RAST RAST = radioallergesorbent test quantification des IgE spécifiques

40 A) anticorps/antigène
Immunodétection RAST = quantification des IgE spécifiques

41 A) anticorps/antigène
Immunodétection Test au C1q Le complexe C1

42 La liaison de C1q à deux Ig ou plus n’est possible que si ces dernières appartiennent à un même complexe immun ou si elles sont fixées sur une même surface

43 A) anticorps/antigène
Immunodétection Test au C1q C1q Ac libre Complexe immun

44 Mesure l'activité fonctionnelle du complément
B) Propriétés du complément CH50 Mesure l'activité fonctionnelle du complément

45 Lyse de la cellule cible
Voie lectine complément C3 Voie classique C1, C4, C2 Amplification P, B, D Voie alterne P, C3, B, D C3b Lyse de la cellule cible C5-C9

46 B) Propriétés du complément CH50
Sérum patient Globule rouge sensibilisé par Ac Destruction du globule rouge

47 B) Propriétés du complément CH50
Sérum patient Complément Quantification: quantité de sérum nécessaire pour lyser 50% des globules rouges

48 B) Propriétés du complément CH50
Sérum patient Complément Quelle(s) protéine(s) du complément est (sont) absente(s) ou non fonctionnelle(s)?

49 B) Propriétés du complément

50 C) Réponses lymphocytaires
Test de lymphoprolifération aux mitogènes Test de culture mixte (MLR)

51 C) Réponses lymphocytaires
Test de lymphoprolifération aux mitogènes Les lymphocytes sont-ils capables de répondre à un mitogène non spécifique? Détection immunodéficience

52 Comment observer les réponses des lymphocytes T in vitro?
Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium dans le DNA Radioactivité Quantité d’antigène

53 Prolifération lymphocytaire en présence de mitogène?
Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium dans le DNA Mitogène 60 50 40 Radioactivité 30 20 10 2.5 5 7.5 10 Mitogène

54 Prolifération lymphocytaire en présence de mitogène?
Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium dans le DNA Radioactivité Patient immunodéficient Mitogène

55 Greffe C) Réponses lymphocytaires Cultures mixtes (MLR)?
Les lymphocytes d'un patient réagissent-elles contre les cellules du donneur ? Greffe

56 Prolifération lymphocytaire
Cellules donneur (irradiées) Pas de réaction Radioactivité 60 50 Réaction receveur-donneur Radioactivité 40 30 20 10 Cellules receveur 2.5 5 7.5 10 Cellules du donneur