Thèse de doctorat vétérinaire

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1 Thèse de doctorat vétérinaire
« Etude de la cellule souche d’organe présente chez le sang du chien et la rate de la souris » Yoann DÉSIR Françoise QUINTIN COLONNA Gilbert MOUTHON Marie-Louise LABAT

2 PLAN Introduction Conclusion I. Etude bibliographique
1. Une cellule souche adulte pluripotente présente dans le sang de l'Homme 2. De l’homme à la souris : pourquoi une étude chez l’animal ? 3. Qu'est-ce que la crète neurale ? II. Etude expérimentale chez la Souris et le Chien 1. Matériel et méthodes 2. Résultats 3. Discussion Conclusion

3 INTRODUCTION Cellules souches « totipotentes »
¤ capacité à donner l’organisme entier ¤ potentiel de différenciation vers tous les types cellulaires (y compris le placenta) Cellules souches « pluripotentes » ¤ capacité à donner les cellules de l’endoderme, du mésoderme et de l’ectoderme ¤ impossible d’engendrer les cellules du trophoblaste Cellules souches adultes ¤ découvertes relativement récemment ¤ potentiel de 50 à 70 divisions au cours de la vie ¤ elles donnent des types cellulaires variés, d’où un caractère « multipotent » Cellules souches d’organe ¤ caractère « pluripotent » c’est-à-dire capables de donner des types celllulaire d’un feuillet embryonnaire différent de celui de l’organe où on les trouve. ¤ capacité de circulation dans l’organisme et de transdifférenciation pour réparer les lésions. ¤ potentiel de division restreint par opposition aux cellules souches embryonnaires. ¤ régulation originale par des lymphocytes T CD4+ « phagiques ».

4 Etude bibliographique d’une cellule souche adulte pluripotente présente dans le sang de l’homme
1991 : Labat et coll. étudient l’ostéomyélosclérose et la maladie d’Engelmann : Mise en évidence de la différenciation de monocytes en fibroblastes ¤ monocytes : immunofluorescence identifiant HLA-DR (CMH II), CD14 (LPS) et CD68 ¤ fibroblastes : produisant la prolyl-4-hydroxylase

5 Etude bibliographique
1991 à nouveau : Labat et coll. : cas humain de mucoviscidose Différenciation de monocytes sanguins en « néofibroblastes » (cultures d’échantillons sanguins sur 30 jours) ¤ monocytes : identifiés par HLA-DR (CMH II), CD14 (LPS) et CD68, mais aussi par l’activité d’enzymes estérases non-spécifiques ¤ fibroblastes : produisant la prolyl-4-hydroxylase mais plus d’estérases Stimulation des lymphocytes T par la Phytohémagglutinine A puis l’Interleukine 2 : ¤ survie plus longue des lymphocytes T stimulés ¤ absence de différenciation des monocytes en fibroblastes

6 Etude bibliographique
1992 : investigation du mécanisme de contrôle par les lymphocytes T (Labat et coll.) ¤ coupes cellulaires : contacts intimes entre les néofibroblastes et les lymphocytes T ¤ présence de noyaux de lymphocytes T dans les cellules différenciées ¤ étude de l’influence humorale : le milieu de culture stimule les néofibroblastes au lieu de les inhiber Conséquence : l’interaction régulatrice lymphocyte T / néofibroblaste apparaît de nature cellulaire.

7 Etude bibliographique
1994 : un cas de greffe cardiaque corrobore les hypothèses de régulation par les lymphocytes T (Labat et coll.) ¤ traitement immunosuppresseur par la ciclosporine ¤ lymphocytes T inhibés ¤ prolifération de néofibroblastes non-régulés ¤ d’où explication de la fibrose pulmonaire rencontrée chez le patient

8 Etude bibliographique
1995 : un cas de vitréorétinopathie humaine (Reuter et coll.) où les monocytes se différencient en fibroblastes ¤ recherche de l’origine de la prolifération de fibroblastes dans cette maladie par emploi d’humeur vitrée de veau ¤ mise en évidence de marqueurs CD11c, CD18 et CD68 qui marquent les monocytes/macrophages ¤ d’où explication de la fibrose du corps vitré

9 Etude bibliographique
1997 : un cas de chondrosarcome (Labat et coll.) où les monocytes se différencient en fibroblastes et en cellules ressemblant à des chondrocytes ¤ mise en évidence de marqueurs HLA-DR, CD14 (monocytes/macrophages) mais aussi prolyl-4-hydroxylase et collagène I, II et III (fibroblastes) ainsi qu’une activité phosphatase alcaline (ostéoblastes et chondrocytes avant minéralisation) ¤ hypothèse d’une déficience in vivo des lymphocytes T (rétrovirus) qui explique la prolifération des néofibroblastes qui prennent une apparence de chondrocytes et forment des nodules.

10 Etude bibliographique
2000 : mise en évidence du polymorphisme des néofibroblastes révélant des marqueurs d’origine neurale par immunofluorescence (Labat et coll.) ¤ à partir de cellules sanguines de donneurs en bonne santé, sans facteurs de croissance ¤ polymorphisme : aspect fibroblastique, cellule radiée, forme amiboïde, cellule en tige, forme avec de longs filopodes. ¤ marqueurs d’origine neurale : synaptophysine, neurofilament NF160, Neurone-Specific Enolase (NSE), protéine S100. ¤ autres marqueurs : vimentine, fibronectine, Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP). hypothèse : origine de ces cellules dans la crète neurale

11 Etude bibliographique
Les cellules monocytoïdes : Polymorphisme physiologique et origine dans la crète neurale Potentiel de différenciation en : ¤ néofibroblastes (culture sanguine physiologique) ¤ (évent.) cellules microgliales (synthétisant naturellement la lipocortine 1) venant du tube neural ¤ ostéoblastes (ostéomyélosclérose) ¤ chondrocytes (chondrosarcome) ¤ myofibroblastes (fibrose pulmonaire) ¤ cellule sécrétant de l’uromoduline (fibrose vésicale) ¤ cellule synthétisant une matrice extracellulaire PrP-like (tremblante ovine) Conclusion : existence de cellules multipotentes, ectomésenchymateuses, capables de prolifération, conjointement aux cellules souches mésenchymateuses.

12 Etude bibliographique
2000 : Zvaifler et coll. : cellules sanguines mésenchymateuses précurseurs (BMPC) ¤ prennent un aspect fibroblastique en culture à long terme ¤ sans CD14, ni CMH II, ni CD34 (marqueur de moelle osseuse) ¤ avec supplément ostéogénique : aspect ostéoblastique, expression de phosphatase alcaline et de Bone Morphogenetic Protein (BMP) ¤ potentiel de différenciation en adipocytes soudanophiles 2001 : Pittenger : cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse ¤ potentiel de différenciation en myoblastes, chondroblastes, adipocytes ¤ donnant les cellules musculaires lisses, en commun avec les cellules monocytoïdes ¤ sans CD14 ni CMH II Conclusion : deux types de cellules souches apparentées, mais distinctes de celles décrites par Labat et coll.

13 Etude bibliographique
2001 : prise de vue micro-cinématographique des lymphocytes T attaquant in vitro les cellules monocytoïdes (Labat et coll.) ¤ circulation des lymphocytes T autour des cellules monocytoïdes différenciées ¤ adhésion cellulaire puis passage des lymphocytes à travers la membrane plasmique des cellules cibles ¤ circulation des lymphocytes T dans le cytoplasme des cellules monocytoïdes, qui prennent un phénotype allongé ¤ interaction destructrice avec le cytosquelette ¤ explosion des cellules monocytoïdes ¤ libération des lymphocytes T phagiques qui peuvent agir de nouveau. Il s’agit d’une régulation immunologique originale. Les lymphocytes T phagiques peuvent (peut-être) sculpter in vivo les sites de réparation lésionnels pour éviter les proliférations excessives.

14 Etude bibliographique
2003 : Zhao, Glesne et Huberman : f-MΦ (macrophages fibroblastiques) ¤ stimulation par le M-CSF de cellules sanguines d’où différenciation en f-macrophages ¤ selon les facteurs de croissance : - LPS : macrophages - IL-2 : lymphocytes T CD8+ voire CD4+ - EGF : cellules épithéliales - NGF : cellules d’aspect neuronal - VEGF : cellules endothéliales ¤ stimulation clonale des f-macrophages : Différenciation en cellules hépatiques, endothéliales, neurales, epithéliales ou en lymphocytes. CONCLUSION : Il existe donc dans le sang de l'Homme une cellule souche pluripotente, circulant sous l'apparence d'un monocyte, et régulée par un mécanisme immunologique tout à fait original.

15 2. De l’homme à la souris et au chien : pourquoi une étude chez l’animal ?
1989 et 1992 : Godoy et coll. décrivent chez la souris la différenciation de macrophages en cellules d’aspect fibroblastique (cas de schisostomose chronique) 2002 : stage au laboratoire d’immunologie : la même cellule est retrouvée chez le chien (échantillons sanguins) et étudiée chez la souris (prélèvements de rate) : Coloration par cytochimie : May-Grünwald et Giemsa Estérases non-spécifiques Immunofluorescence indirecte : neuron-specific enolase autres marqueurs des cellules nerveuses dont la nestine neurofilament NF160

16 3. Qu’est-ce que la crète neurale ?
Origine de la crète neurale : ¤ détachement de la plaque neurale au cours de la 4ème semaine de développement ¤ migration des cellules vers les différents tissus de l’embryon Différenciation des cellules issues de la crète neurale en : ¤ cellules nerveuses des ganglions rachidiens et sympathiques ¤ cellules de la médullo-surrénale et cellules endocrines à ACTH et à calcitonine ¤ cellules pigmentaires ¤ cellules à l’origine des os du crâne ¤ certaines cellules souches d’organe

17 Etude expérimentale chez la souris et le chien
1. Matériel et méthodes Réactifs et matériels de culture Origine des différentes substances et réactifs (Prolabo, Gibco, Sigma, Histologie ENVA) Anticorps utilisés : - NSE : anticorps monoclonal de souris - Synaptophysine : anticorps de souris et de lapin polyclonal - Nestine : anticorps monoclonal de souris

18 ETUDE EXPERIMENTALE Mise en culture à long terme des cellules de rate de souris : Souris C57B6 Milieu pendant 3 semaines : RPMI + serum de veau fœtal + AB Culture de cellules sanguines de chien : Isolement par centrifugation des cellules mononucléées D’où deux types cellulaires primordiaux : monocytes d’origine médullaire qui survivent quelques jours, et cellules monocytoïdes d’origine neurale supposée, observés pendant 3 semaines.

19 ETUDE EXPERIMENTALE Stimulation des lymphocytes T canins et murins par la PHA, la Concanavaline A et l’ IL-2 : PHA ou ConA (mitogènes) d’où activation polyclonale Puis stimulation par l’IL-2 après 3 jours de culture qui évite l’apoptose des lymphocytes T Immunofluorescence indirecte : Fixation par l’acétone et le formaldéhyde, d’où perméabilité membranaire et visualisation de composés cytosoliques Blocage des sites non-spécifiques à l’aide de serum de chèvre (l’anticorps secondaire ne les reconnaîtra pas) Incubation 1 heure avec l’anticorps primaire Incubation 1 heure avec l’anticorps secondaire fluorescent de chèvre

20 ETUDE EXPERIMENTALE Cytochimie Coloration au May-Grünwald et Giemsa :
Colorant de May-Grünwald (fixation 3 min) Eau distillée tamponnée pH 7,2 (rinçage 1 min) Colorant de Giemsa (coloration pendant 20 min) Coloration des estérases non-spécifiques : Hydrolyse de l’alpha-naphtylbutyrate en composé rouge par les estérases Contre-coloration en bleu par le vert de méthyle Les cellules monocytes et monocytoïdes sont rouges Les lymphocytes apparaissent bleus

21 RESULTATS Mise en culture chez le Chien
Cellules souches monocytoïdes sans coloration : - Témoin cellules : « œuf sur le plat » et « à dendrites » - Attaque des cellules monocytoïdes par des lymphocytes T (2 heures) :

22 RESULTATS Mise en culture chez le Chien
Cellules souches monocytoïdes sans coloration : - Cellules monocytoïdes reconnues par des lymphocytes T stimulés par PHA et IL2 : - Destruction d’une cellule monocytoïde par les lymphocytes T stimulés :

23 RESULTATS Caractérisation par cytochimie
Coloration de May-Grünwald et Giemsa : - Les cellules adhérentes périphériques sont à gros noyau basophile : ce sont soit des lymphocytes T phagiques, soit des cellules souches peu différenciées. Coloration par les estérases non-spécifiques : - sans mitogène : Les lymphocytes T sont distingués par la coloration au vert de méthyle, et adhèrent aux cellules monocytoïdes rouges.

24 RESULTATS Immunofluorescence chez la souris
Immunofluorescence indirecte : mise en évidence de la synaptophysine De grandes cellules à longs prolongements témoin anticorps secondaire : les cellules sont marquées par la synaptophysine en IF indirecte ne sont que peu marquées par la fluorescéine.

25 RESULTATS Immunofluorescence chez la souris
Immunofluorescence indirecte : mise en évidence de la synaptophysine (2) La morphologie des cellules spléniques varie : de grandes cellules rondes à gros noyau voisinent d’autres cellules plus effilées à longs prolongements.

26 RESULTATS Immunofluorescence chez la souris
Immunofluorescence indirecte : mise en évidence de la neuron-specific enolase (NSE) Les cellules spléniques affichent un noyau très fluorescent : en raison de la technique utilisée, les anticorps peuvent marquer la NSE présente aussi sur la membrane nucléaire.

27 RESULTATS Immunofluorescence chez la souris
Immunofluorescence indirecte : témoin anticorps secondaire (γNSE) Sans l’anticorps anti-γNSE, les cellules spléniques sont peu fluorescentes ; l’expérience est donc significative : les cellules spléniques mises en culture sont porteuses de la γNSE.

28 DISCUSSION Mise en évidence chez le chien comme chez la souris :
- cellules de phénotype variable : rondes à grand noyau, ou allongées avec de longs filopodes - durée de vie : de l’ordre de 3 semaines, sans facteurs de croissance spécifiques. Caractérisation : - cellules dites « monocytoïdes » car estérases + - cellules sanguines et lymphatiques d’origine neurectodermique car porteuses de marqueurs d’origine neurale (absents des monocytes) : nestine, NSE, synaptophysine. Mécanisme de régulation : Identique à celui décrit par Labat et coll. chez l’homme ? Arguments : - adhésion cellules monocytoïdes / lymphocytes - lyse des cellules, qui prennent alors souvent un phénotype allongé

29 Conclusion Découverte de cellules souches d’organe riche en enseignements : - possibilité de régénération des organes à l’âge adulte - circulation des cellules souches sous l’aspect d’un monocyte dans le sang et la lymphe, ainsi que les organes lymphoïdes II comme la rate. Mécanisme de régulation fascinant : - fusion des cellules régulatrices, appelées « lymphocytes T phagiques », avec les cellules cibles - circulation des lymphocytes dans les cellules à stopper de manière à les lyser exception à la tolérance au "soi " puisque les cellules immunitaires détruisent physiologiquement des cellules naturelles. Hypothèses pour la reconnaissance : - reconnaissance impliquant le TCR des lymphocytes T qui serait peut-être de type γδ - différenciation des cellules cibles en exprimant un marqueur reconnu par les LT phagiques, comme CD 34 par exemple, qui aboutirait à la lyse des cellules en excès.

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37 Remerciements : Françoise Quintin Colonna, Professeur à l'Ecole Vétérinaire de Maisons-Alfort Marie-Louise Labat, Directrice de Recherche au C.N.R.S. Françoise Gavard, Responsable de Laboratoire à l’E.N.V.A. Gilbert Mouthon, Directeur de thèse et Professeur à l’Ecole Vétérinaire de Maisons-Alfort Naïma Kasbaoui, Docteur vétérinaire Carole Sapède, Docteur vétérinaire Laure Moro, Docteur vétérinaire Manuel Giovanetto, Docteur vétérinaire