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Techniques immunologiques par Mme Boumendjel Messarah A. Année 2008/2009 Université Badji Mokhtar (Annaba) Cours de techniques immunologiques.

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1 Techniques immunologiques par Mme Boumendjel Messarah A. Année 2008/2009 Université Badji Mokhtar (Annaba) Cours de techniques immunologiques

2 Cytométrie en flux

3 Exemple dapplication de la cytométrie en flux: Etude de lexpression du récepteur de lIL-27 sur les lymphocytes B

4 Cellules B spléniques CD19+ (naïves et mémoires) Cellules B ombilicales naïves CD19+CD27- Obtention des Lymphocytes B humains A partir de fragments de rate Par Sélection positive (Microbeads, MACS) et tri magnétique préparatif (Miltenyi Biotech) A partir du sang de cordon Par Déplétion négative (Rosettesep, StemCell) Marquage magnétique (30 min) Séparation magnétique Elution des cellules marquées Ajout du cocktail Rosettessep Ac anti-CD2, CD3, CD16, CD36, CD56 et CD66b couplés à des anticorps anti-glycophorine A Formation dimmunorosettes Collecte des cellules à linterface Plasma/Ficoll

5 Mise en culture des cellules B naïves ou mémoires Anti-CD40 IL-27, IL-21, IL-4 Après 4 jours Incorporation de la H3-thymidine Mesure de la radioactivité incorporée par lADN cellulaire Après 12 jours Dosage ELISA: - IgE - isotypes dIgG Récupérer les surnageants de culture Mise en culture dans du milieu YSSEL (10% SVF) 5% CO 2 à 37°C Détermination de la réponse proliférativeProduction dIgE et dIgG

6 Analyse de lexpression de lIL-27R et des différents autres marqueurs membranaires Marquage direct ou indirect par immunofluorescence simple, double ou triple En utilisant des Ac couplés aux fluorochromes (FITC, PE ou APC) Passage au cytomètre (FACSCan BD) et/ou Tri cellulaire (FACS Vantage BD) et enfin analyse par le logiciel Cell Quest

7 Expression des sous unités (TCCR et gp130) du récepteur de lIL-27 sur les cellules B Cellules B naïves (CD19+CD27-) du sang de cordon Cellules B naïves (CD27-) de la rate Cellules B mémoires (CD27+) de la rate Selon la littérature (Larousserie et al., 2006) : les 2 sous unités de lIL-27R sont constitutivement exprimées Sur les Lc B damygdales humains naïfs et mémoires


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