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Translocation of surface-localized effectors in type III secretion Responsable de latelier Sophie BLEVES Lamia MEBARKI Karen Akopyana,1, Tomas Edgrena,1,

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1 Translocation of surface-localized effectors in type III secretion Responsable de latelier Sophie BLEVES Lamia MEBARKI Karen Akopyana,1, Tomas Edgrena,1, Helen Wang-Edgrena, Roland Rosqvista,b, Anna Fahlgrena, Hans Wolf-Watza, and Maria Fallmana,2 Department of Molecular Biology, Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden, Umeå Centre for Microbial Research, and bThe Electron Microscopy Platform at the Chemical Biological Centre, Umeå University, SE Umeå, Sweden Edited* by Thomas J. Silhavy, Princeton University, Princeton, NJ, and approved December 21, 2010 (received for review September 16, 2010)

2 Introduction Beaucoup de bactéries Enteropathogènes possèdent un système de sécrétion type III ( SST3) essentiel pour leurs virulence, capable de produire des interactions entre la bactérie et la cellule eucaryote par la translocation directe des protéines virulentes dans le cytosol de la cellule hôte. Définitions Selon le mode de vie de lagent pathogène, les protéines effectrices transloquées interférent avec différentes voies de signalisation et de régulation de la réponse immunitaire innée dans la cellule hôte ce qui fait pencher la balance en faveur de le bactérie. Les pathogènes de Yersinia: 3 espèces Y. enterocolitica Y. pseudotuberculosis y. pestis SST3 plasmidique Chez Yersinia

3 Les effecteurs transloqués sont appelés: Yops qui permettent la survie extracellulaire des Yersinia Action antiphagocytaire + apoptose du macrophage Injection des effecteurs en UNE étape à travers un canal continu construit par Ysc/Yop SST3 Deux protéines secrétées appelées translocateurs: YopB et YopD Translocation des protéines effectrices dans la cellule cible YopB et YopD ont un domaine hydrophobe et peuvent être insérées dans les membranes des érythrocytes + cellules nucléées Formation dun pore

4 La liaison de Yersinia + cellule cible déclanche la sécrétion et linsertion de YopB et YopD dans la membrane plasmique de la cellule cible, en complétant le conduit entre la bactérie et la cellule cible par le complexe daiguille SST3. Les effecteurs sont transportés dans le cytoplasme de la cellule hôte via ce pore pendant létape de translocation. Objectifs: Les mécanismes conduisant à la translocation des protéines SST3 dépendantes. Les conditions qui permettent la translocation des effecteurs in vitro. Montrer que les protéines effectrices associées à la surface des cellules sont transportées dune manière SST3 dépendante.

5 Résultats Localisation des Yops Cellules HeLa infecté par Yersinia pseudotuberculosis La membrane externe de la bactérie est en contacte étroit avec la membrane de la cellule HeLa Aucune structure de transition. Aucune organisation spatiale. ? Immunoelectron Microscopy YopE

6 Localisation de YopE dans une souche de Y. pseudotuberculosis wilde type YPIII/pIB102 avant le contacte avec la cellule cible. YopE nest pas localisé avec les protéines yscF de laiguille proteinA-gold 5 nM= YopE 10 nM= yscF yscF

7 Traitement a la protéinase K les Yops sont localisés sur la surface de Y. pseudotuberculosis avant le contacte avec la cellule cible.

8 Rôle de YopH localisé a la surface des cellules de Y. pseudotuberculosis Les YopH localisés à la surface des cellules peuvent bloquer immédiatement la réponse précoce en Ca 2+ dans les neutrophiles infectés.

9 Anderson et al; 1999 Yersinia pseudotuberculosis-Induced Calcium Signaling in Neutrophils Is Blocked by the Virulence Effector YopH

10 Lajout externe de YopH purifier in vitro

11 les protéines effectrices ajoutées in vitro et ensuite trouvées sur la surface de Y. tuberculosis sont fonctionnelles et peuvent être transloquées dans les cellules cibles par un mécanisme SST3 dépendant.

12 Dosage directe de la translocation des yopH

13 Démonstration de l'internalisation des effecteurs en utilisant la méthode FRET ( fluorescence energy transfer )

14 La translocation des effecteurs ajoutés dans le milieux externe ne sapplique pas exclusivement à YopH. Les fusions YopH-Bla purifiés sont transporté a lintérieur de la cellules cible. La localisation des Yops à la surface des bactéries nest pas SST3 dépendant.

15 Sécrétion et translocation Souche MYM Aucune translocation des effecteurs na été observer chez les souches MYMΔBD.

16 Sory et al 1995 La translocation des YopH localisées sur la surface des souches de Y. pseudotuberculosis in-vitro nécessite un domaine de translocation qui est distinct du signal de sécrétion. La sécrétion et la translocation peuvent être découplées dans la translocation des protéines SST3 dépendantes de Y. pseudotuberculosis

17 Est-ce que dautre système de sécrétion type III ont la capacité à transloquer les YopH localisés a la surface des cellules? Exp: SPI-1 chez salmonella typhimurium

18 YopH1-17: pas transloquer. YopH18-49 même % de translocation YopH1-99. La translocation des YopH par S. typhimurium est dépendante sur le même domaine de translocation que dans les YopH observé dans Yersinia S. Typhimurium peut favoriser la translocation de YopH1-99 ajouté au milieu externe de manière SPI-1 dépendant. En plus:

19 Conclusions et Discussion Les effecteurs ( SST3) localisés sur la surface de Y.pseudotuberculosis peuvent être transportés dans les cellules hotes de façon SST3- dépendante. YopH, YopE, YopB et YopD (fonctionnels) se trouvent principalement à la surface de la bactérie avant quelle nentre en contact avec une cellule cible. Un modèle de translocation des protéines SST3-dépendant qui précède la translocation polarisé par la formation dun intermédiaire extracellulaire effecteur/ translocateur. Caractéristique générale des pathogènes SST3-dépendant La forme intermédiaire de translocation pourrai être soit : Complexe préformé à la surface de la bactérie Complexe transitoire qui est assemblé dans la membrane plasmique des cellules cibles lors du contact avec la bactérie.

20 Les acides aminés 18 à 49 de YopH et les domaine hydrophobes des translocateurs YopB et YopD, sont nécessaire a la translocation des fusions YopH-Bla ajoutée a lextérieur. Le domaine de translocation de YopH joue un rôle dans la translocation SST3-dépendant de cet effecteur en dehors de la bactérie. Les translocateur : IpaB, IpaC et IpaD de Shigella flexini, aussi SipB et SipD chez S. typhimurium se trouvent à la surface de la bactérie mais pas les effecteurs Cela nexclu pas la présence dune forme intermédiaire.? La translocation réelle pourrait être accompli par un système binaire: mécanisme AB-toxine

21 Eucaryotic cell Une seul étape Deux étapes 12 Milieux extérieur : Translocateur : Effecteur = Eucaryotic cell Bacterial cell Bacterial cell Bacterial cell

22

23 Fig. S4. Internalization of YopH1–99-Bla coated Y. pseudotuberculosis strains by HeLa cells. Relative survival of YopH1–99-Bla coated Y. pseudotuberculosis strains recovered after gentamicin protection assays. Additions of Cytochalacin D (CytD, 0.5 μg/mL) are indicated below the graph. YopH1–99-Bla coated Y. pseudotuberculosis strains: plasmid cured mutant (YPIII + YopH-Bla), yopH-deletion mutant (ΔyopH + YopH-Bla), multiple yop mutant (MYM + YopH-Bla) and an isogenic multiple yop mutant deleted for yopB and yopD (MYMΔBD + YopH-Bla). Data are presented as mean ± SEM of four independent experiments.


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