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Dyskératose congénitale et biogénèse des RNA H/ACA. Christian Trahan et François Dragon, Centre BioMed, Département des sciences biologiques, UQÀM.

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1 Dyskératose congénitale et biogénèse des RNA H/ACA. Christian Trahan et François Dragon, Centre BioMed, Département des sciences biologiques, UQÀM.

2 Pathologie qui affecte les tissus à haut renouvellement diagnostique difficile en raison des désordres variés: Hyperpigmentation de la peau (89%) Dysplasie des ongles (88%) Aplasie de la moelle osseuse (86%) Leucoplasies des muqueuses (78%) Pathologies pulmonaires (20%) Perte prématurée des cheveux (16%) Tendance à la malignité (10%) Ostéoporose (10%) Aplasie de la moelle osseuse (86%) Dyskératose congénitale (DC)

3 Petite stature /retard de développementMicrocéphalie Épiphora Hypoplasie cérébellaireNécrose avasculaire des articulations Problèmes gastroentériqueDéficiences immunologique Perte prématurée des dents Autres désordres: autres… Des mutations génétiques dans 6 gènes ont été identifiés chez environ la moitié des individus répertoriés au DCR (Londre) Les gènes impliqués fonctionnent dans la biologie des télomères: Autres désordres:

4 [TTAGGG]n [AATCCC]n 2-30 kpb b 3 5 [TTAGGG]n [AATCCC]n T-loop D-loop 5 3 Problème de réplication des extrémités chromosomiques fourche de réplication 3 5 synthèse du brin avancé 3 5 Synthèse du brin retardé Extension et dégradation des amorces Télomères et problème de réplication DNA télomérique

5 Transcriptase inverse (hTERT) RNA (hTR) 3 5 CAAUCCCAAUC Transcriptase inverse (hTERT) RNA (hTR) 3 5 CAAUCCCAAUC b GGTTAGGGTTAG GGTTAG n GGTTAG Extension des télomères par la télomérase

6 Structure secondaire de hTR et mutations causant la DC. snoRNA scaRNA rRNA snRNA ψψ

7 GAR1 NAF1 (3) (2) CTD polII Nucléole, Corps de Cajal Noyau Site de transcription des RNA H/ACA Modèle de la biogénèse des RNA H/ACA in vivo. dyskérine NAF1 NOP10 NHP2

8 Gènes reliés à la DC TIN2 (AD)– composante du complexe shelterin qui protège et régule les télomères. hTERT (AD-AR)– transcriptase inverse de la télomérase. hTR (AD)– composante ribonucléique de la télomérase. Dyskérine (lié au X) / NHP2 (AR) / NOP10 (AR)– protéines communes à la télomérase, ainsi quaux petits RNA H/ACA (snoRNA/scaRNA).

9 Raccourcissement des télomères transmis à chaque génération. La DC est donc principalement considérée comme un problème de la biologie des télomères. Corrélation entre la longueur des télomères et lapparition des phénotypes. To fix

10 1er chapitre Dyskeratosis congenita mutations in the H/ACA domain of human telomerase RNA affect its assembly into a pre-RNP. RNA : originally published online December 17, 2008 Christian Trahan and François Dragon

11 Méthodologie; Reconstitution et analyse de complexes H/ACA in vitro. Transcription/traduction in vitro ( 35 S-méthionine) NAF1 Dyskérine Fibrillarine CTRL- NHP2 NOP10 IP dyskérine ou NAF1 SDS-PAGE 4-12% fixation, séchage sur papier à chromatographie et analyse sur un Molecular Imager FX. Analyse des RNA sur Molecular Imager FX 35 S transparent Analyse surnageantsSDS-PAGE 4-12% Transcription in vitro ( 32 P-CTP) hTR204 hTR204 mutés U3 RNA CTRL- Purification sur gel IP dyskérine ou NAF1

12 Domaine H/ACA de hTR et ses dérivés utilisés. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Inv C408G

13 Le tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 sassemble correctement NAF1 Dysk. fibrillarine NHP2 NOP10 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 fibrillarine NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 T IP T IP T IP T IP T IP T IP T IP - NAF1 - NHP2 - NOP10 - NAF1, NOP10 - NAF1, NHP2 - dysk. Toutes IP dyskérine

14 Le tétramère lie spécifiquement le domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

15 dyskérine-NOP10-NHP2; un minimum requis pour lier hTR204. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

16 NAF1 requiert la présence du trimère pour sassocier à hTR204. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

17 NAF1 requiert la présence du trimère pour sassocier aux RNA H/ACA NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

18 Les mutations dans les boîtes H et ACA abolissent la formation de pre-RNP NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

19 Les mutations C408G et empêchent la formation de pre-RNP NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

20 Conclusions Notre système de reconstitution in vitro récapitule lassemblage précoce du domaine H/ACA de hTR tel que rapporté in vivo. Ce système nous a permis danalyser leffet de mutations dans ce domaine sur lassemblage de la RNP. Nous démontrons pour la première fois que la délétion Δ ainsi que la mutation ponctuelle C408G abolissent la liaison du tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 au domaine H/ACA de hTR. Nos résultats suggèrent que les mutations C408G et Δ engendrent des défauts dassemblage in vivo, ce qui entraîne probablement la dégradation de hTR et conduit tout droit à la DC. Aucun défaut dassemblage nest causé par la mutation C450A na pu être détecté dans notre système.

21 2e chapitre Dyskeratosis congenita mutations in dyskerin, NHP2 and NOP10 differently affect the assembly of H/ACA pre-RNPs Soumis à EMBO Journal septembre 2009 Christian Trahan, Caroline Martel and François Dragon

22 Structure dune sRNP archaebactérienne

23 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Mutations dans dyskérine reliées à la DC

24 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Mutations dans dyskérine reliées à la DC

25 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Mutations dans dyskérine reliées à la DC

26 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Mutations dans NHP2 reliées à la DC

27 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Mutations dans NHP2 reliées à la DC

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29 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Mutations dans NOP10 reliées à la DC

30 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Mutations dans NOP10 reliées à la DC

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32 Conclusion Notre système de reconstitution in vitro récapitule lassemblage précoce du domaine H/ACA de hTR tel que rapporté in vivo. Ce système nous a permis danalyser leffet de mutations dans ce domaine sur lassemblage de la RNP. Nous démontrons pour la première fois que la délétion Δ ainsi que la mutation ponctuelle C408G abolissent la liaison du tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 au domaine H/ACA de hTR. Nos résultats suggèrent que les mutations C408G et Δ engendrent des défauts dassemblage in vivo, ce qui entraîne probablement la dégradation de hTR et conduit tout droit à la DC. Aucun défaut dassemblage nest causé par la mutation C450A na pu être détecté dans notre système.

33 3e chapitre Unusual polyadenylation of hTR In preparation for Nucleic Acids Research journal, 2009 Christian Trahan et François Dragon

34 Hypothèse de départ: défaut de maturation du mutant G450A de hTR AGTTCGCT… AGTTCGCT… A

35 Méthodologie; 3 RLM-RACE cellules VA-13 (hTR négatives) Microporation hTR-500 hTR-G450A-500 RNA total (QIAGEN RNeasy) Dnase Rnase free (sur colonne) Ligation dun adaptateur miRCAT-33 rApp ddC Rnase Dnase free RT PCR EcoRI T4 PNK pBS EcoRVEcoRI T4 RNA ligase 2 tronquée EcoRI

36 hTR WThTR-G450A Mature 3end 3 genomic sequence Mature 3end 3 genomic sequence TGCAGTTCGCTTTCC…frequencyTACAGTTCGCTTTCC… frequency TGC1/9TAC 4/9 TGCA2/9TAC AG1/9 TGCAA1/9TAC AGAA1/9 TGCAAAA1/9TAC AAAA1/9 TGCAGAAA1/9TAC AGTTC1/9 TGCAGTTCGCT2/9TAC AGTTCGCT1/9 TGCAGTTCGCTT1/9

37 HeLaBeWo Mature 3end 3 genomic sequencefrequency Mature 3end 3 genomic sequencefrequency TGCAGTTCGCTTTCC…TGCAGTTCGCTTTCC… TGC6/11TGC9/12 TGC A 2/11TGC A 1/12 TGC AG 1/11TGC AAAAA 1/12 TGC AGAAAAA 1/11TGC AGTA 1/12 TGCAAAAAA1/11

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39 Conclusions

40 Perspectives

41 Remerciements François Dragon, Directeur les membres du laboratoire Yves Henry, CNRS Toulouse. Lapins Néo-Zélandais blanc Caroline Martel, assistante de recherche. Chantal Autexier, McGill. Gabriele Varani and Steve Reichow, University of Washington


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