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Biogenèse de la télomérase chez lhumain. Christian Trahan Centre BioMed, Département des sciences biologiques, UQÀM.

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1 Biogenèse de la télomérase chez lhumain. Christian Trahan Centre BioMed, Département des sciences biologiques, UQÀM.

2 Aplasie de la moelle osseuse (86%) Pathologie qui affecte principalement les tissus à haut renouvellement diagnostique difficile en raison des désordres variés: Hyperpigmentation de la peau (89%) Dysplasie des ongles (88%) Leucoplasies des muqueuses (78%) Pathologies pulmonaires (20%) Perte prématurée des cheveux (16%) Tendance à la malignité (10%) Ostéoporose (10%) Dyskératose congénitale (DC)

3 Petite stature /retard de développementMicrocéphalie Épiphora Hypoplasie cérébellaireNécrose avasculaire des articulations Problèmes gastroentériqueDéficiences immunologique Perte prématurée des dents Autres désordres: autres… Des mutations dans 6 gènes sont responsables de la moitié des cas répertoriés au DCR (Londres). Ces gènes ont en commun une fonction dans la biologie des télomères. Autres désordres:

4 Gènes reliés à la DC TIN2 (AD)– composante du complexe shelterin qui protège et régule les télomères. hTERT (AD-AR)– transcriptase inverse de la télomérase. hTR (AD)– RNA de la télomérase. Dyskérine (XR) NOP10 (AR) NHP2 (AR) protéines communes à la télomérase, ainsi quaux petits RNA H/ACA (snoRNA/scaRNA). La DC est donc principalement considérée comme un défaut dans la biologie des télomères. Les sujets atteints de DC ont des télomères critiquement courts.

5 [TTAGGG]n [AATCCC]n 2-30 kpb b 3 5 [TTAGGG]n [AATCCC]n T-loop D-loop 5 3 Problème de réplication des extrémités chromosomiques fourche de réplication 3 5 synthèse du brin avancé 3 5 Synthèse du brin retardé Extension et dégradation des amorces Télomères et problème de réplication DNA télomérique

6 Transcriptase inverse (hTERT) ARN (hTR) 3 5 CAAUCCCAAUC Transcriptase inverse (hTERT) ARN (hTR) 3 5 CAAUCCCAAUC b GGTTAGGGTTAG GGTTAG n GGTTAG Extension des télomères par la télomérase

7 Structure secondaire de hTR et mutations causant la DC. rRNA (ribosome) snRNA (spliceosome) ψψ snoRNA scaRNA

8 GAR1 NAF1 Nucléole ou Corps de Cajal Noyau Site de transcription des ARN H/ACA Modèle de la biogénèse des RNA H/ACA in vivo. Cytoplasme dyskérine NAF1 NOP10 NHP2 Pré-RNP RNP active

9 Problématique et hypothèses Problématique Peu ou pas détude sur lassemblage de complexes H/ACA en relations aux: Hypothèses mutations reliées à la DC dans le domaine H/ACA de hTR. 2.Des mutations dans dyskérine, NOP10 et NHP2 peuvent affecter lassemblage de dautres pré-RNP en plus de lassemblage précoce de la télomérase. mutations dans les protéines dyskérine, NOP10 et NHP2. Les mutations dans dyskérine, NOP10 et NHP2 pourraient-elles affecter dautres RNP en plus daffecter la télomérase? 1.Des mutations dans le domaine H/ACA de hTR interfèrent avec lassemblage de ce domaine en pré-RNP.

10 1er volet Christian Trahan and François Dragon, Dyskeratosis congenita mutations in the H/ACA domain of human telomerase RNA affect its assembly into a pre- RNP. RNA 15 : Des mutations reliées à la DC dans le domaine H/ACA de hTR affecte son assemblage en pré- RNP.

11 Domaine H/ACA de hTR et ses dérivés utilisés. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Inv C408G

12 Méthodologie; Reconstitution et analyse de complexes H/ACA in vitro. Transcription/traduction in vitro ( 35 S-méthionine) NAF1 Dyskérine Fibrillarine CTRL- NHP2 NOP10 IP dyskérine ou NAF1 Gel dacrylamide Bis-Tris 4-12% fixation, séchage sur papier à chromatographie et analyse sur un Molecular Imager FX. Analyse des RNA sur Molecular Imager FX 35 S transparent Analyse surnageants Gel dacrylamide urée Gel dacrylamide Bis-Tris 4-12% Transcription in vitro ( 32 P-CTP) hTR204 hTR204 mutés U3 RNA CTRL- Purification sur gel IP dyskérine ou NAF1

13 Le tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 sassemble correctement. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 T IP T IP T IP T IP T IP - NAF1 - NHP2 - NOP10 - dysk. Toutes IP dyskérine NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 fibrillarine

14 Le tétramère lie spécifiquement le domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 T IP T IP T IP T IP hTR204 - dysk. Toutes RNA NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 fibrillarine hTR204 IP IP dyskérine RNA T IP T IP T IP T IP RNA - NAF1 Toutes hTR204U3 IP NAF1 hTR204 sng U3

15 dyskérine-NOP10-NHP2; un minimum requis pour lier hTR204. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 IP dyskérine T IP T IP T IP T IP T IP T IP T IP - NAF1 - NHP2 - NOP10 - NAF1, NOP10 - NAF1, NHP2 - dysk. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Toutes hTR204 IP hTR204 sng

16 NAF1 requiert la présence du trimère pour sassocier à hTR204. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 T IP T IP T IP T IP T IP T IP T IP - dysk., NOP10 -dysk., NOP10, - NHP2 - NAF1 - dysk. - NOP10 - NHP2 Toutes IP NAF1 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 hTR204 IP hTR204 sng

17 NAF1 requiert la présence du trimère pour sassocier aux RNA H/ACA. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 IP NAF1

18 inv Les boîtes H et ACA dans hTR sont essentielles à la formation de pré-RNP.

19 Les mutations C408G et empêchent la formation de RNP. IP NAF1

20 Conclusions Notre système de reconstitution in vitro est spécifique et récapitule lassemblage précoce du domaine H/ACA de hTR tel que rapporté in vivo. Ce système nous a permis danalyser leffet de mutations dans ce domaine sur lassemblage de la pré-RNP. Contrairement à la boîte CAB, les boîtes H et ACA sont indispensables à la formation de pré-RNP avec hTR204. Nos résultats suggèrent que ces mutations engendrent également des défauts dassemblage in vivo, ce qui entraîne probablement la dégradation de hTR et conduit tout droit à la DC. Les deux mutations reliées à la DC testées abolissent la formation de pré-RNP avec hTR204 alors que la mutation G450A reliée à lanémie aplasique na aucun effet.

21 2e volet Analyse de leffet des mutations associées à la DC dans les protéines dyskérine, NHP2 et NOP10 sur lassemblage de pré-RNP H/ACA Christian Trahan, Caroline Martel and François Dragon, Effects of dyskeratosis congenita mutations in dyskerin, NHP2 and NOP10 on assembly of H/ACA pre-RNPs. Human Molecular Genetics 19 :

22 Structure dune RNP H/ACA darchaebactérie R65T T66A T67I H68Q L72Y Q31E F36V L37del I38T K39E P40R E41K K43E T49M A2V N-terminal P384L P384S A386T L398P G402E G402R T408I P409L S420Y C-terminal del Extensions dyskérine

23 Mutations dans dyskérine reliées à la DC IP NAF1

24 Mutations dans dyskérine reliées à la DC IP NAF1

25 Mutations dans NHP2 reliées à la DC IP NAF1 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

26 Mutations dans NHP2 reliées à la DC

27 Mutation dans NOP10 reliée à la DC IP NAF1 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

28 Mutation dans NOP10 reliée à la DC

29 Conclusion hTR est plus sensible que les autres RNA H/ACA à la mutation A353V dans dyskérine lors de lassemblage de pré-RNP. La mutation R34W dans NOP10 cause un défaut majeur dassemblage de pré-RNP H/ACA ¨classiques¨, alors quelle na aucun effet sur lassemblage de pré-RNP H/ACA encodant des miRNA. Lassociation de NOP10 aux mutants V126M / Y139H de NHP2 est compromise, ce qui engendre par conséquent des défauts majeurs dassemblage de tous les RNA H/ACA.

30 Conclusion Nos résultats démontrent que les mutations dans dyskérine, NOP10 et NHP2 reliées à la DC affectent différentes populations de RNP H/ACA en plus de la télomérase. Cela suggère que certains désordres entre individus atteints de DC pourraient être reliés à différentes populations de RNP H/ACA affectées en plus de la télomérase. Notre étude rend possible le criblage et le développement de petites molécules thérapeutiques personnalisées afin de traiter la DC.

31 3e volet Maturation de hTR. En préparation Christian Trahan, Amed Hossain et François Dragon

32 hTR possède son propre promoteur, est transcrit par la Pol II (présence dune coiffe), et ne possède pas de séquence 5 immature. Tous les ARN sont synthétisés sous forme de précurseurs plus longs in vivo. Extrémités 5 et 3 ou seulement 3. Généralités Une étude démontre que la séquence du domaine H/ACA de hTR contient tous les éléments nécessaires à sa maturation 3 (Fu et Collins, Mol Cell 2003). La longueur de lextrémité 3 de transcrits précurseurs de hTR est toujours indéterminée. Cette même étude fait mention de la présence dun transcrit > 1000 nt amplifié par RT-PCR à partir dARN de cellules HeLa (¨data not shown¨.

33 … Anémie aplasique reliées à la mutation G450A dans hTR

34 … Hypothèse de départ AAGTTCGCT …

35 Méthodologie: 3 RLM-RACE cellules VA-13 (hTR négatives) Transfections RNA total (QIAGEN RNeasy) DNase RNase free (sur colonne) Ligation dun adaptateur miRCAT-33 rApp ddC RNase DNase free RT PCR EcoRI pBS EcoRVEcoRI T4 RNA ligase 2 tronquée EcoRI Prom-hTR+500 Prom-hTRG450A+500 Prom-hTRA446G+500

36 hTR+500hTRG450A+500 Mature 3-end 3 flanking sequence Mature 3-end 3 flanking sequence ACAUGCAGUUCGCUU…FrequencyACAUACAGUUCGCUU…Frequency ACAUGC1/23ACAUAC5/20 ACAUGCA6/23ACAUACA3/20 ACAUGCA1/23ACAUACAAAA1/20 ACAUGCAAAA1/23ACAUACAG3/20 ACAUGCAGAAA3/23ACAUACAGAA1/20 ACAUGCAGUA2/23ACAUACAGAAA1/20 ACAUGCAGUUA1/23ACAUACAGUA1/20 ACAUGCAGUUAAAAA1/23ACAUACAGUUA2/20 ACAUGCAGUUC1/23ACAUACAGUUC1/20 ACAUGCAGUUCGA1/23ACAUACAGUUCGCU1/20 ACAUGCAGUUCGCU2/23ACAUACAGUUCGCUU1/20 ACAUGCAGUUCGCUAA1/23 ACAUGCAGUUCGCUU1/23 ACAUGCAGUUCGCUUA1/23 Le mutant G450A de hTR ninfluence pas la maturation de son extrémité 3

37 Labsence de formation de pré-RNP mène à la dégradation des transcrits

38 Oligo-adénylation de hTR dans des cellules HeLa et BeWo. HeLaBeWo Mature 3-end 3 flanking sequence Mature 3-end 3 flanking sequence ACAUGCAGUUCGCUU…FrequencyACAUGCAGUUCGCUU…Frequency ACAUGC12/18ACAUGC21/26 ACAUGCA3/18ACAUGCA1/26 ACAUGCAG1/18ACAUGCAA1/26 ACAUGCAGAAAAA1/18ACAUGCAGUA1/26 ACAUGCAAAAAA1/18ACAUGCAAAAA1/26 ACAUGCAAAAG1/26

39 Conclusions La mutation G450A dans hTR ne semble pas influencer la maturation de son extrémité 3. Des transcrits de hTR subissent une oligo-adénylation en 3 de la séquence codante, à proximité de la séquence mature de hTR. Limplication de cette oligo-adénylation demeure spéculative: maturation ou dégradation? Les résultats du 3 RLM-RACE du mutant A446G supportent lidée quen absence de formation de pré-RNP, les transcrits naissants sont rapidement dégradés. Des fragments mesurant entre 1000 et 3000 nt ont été amplifiés par 3 RLM-RACE, mais se sont avérés êtres non-spécifiques. Un ou des éléments situés à plus de 500 pb en aval de la séquence codante de hTR contribuent à lefficacité de maturation de lextrémité 3 de hTR.

40 Perspectives des études 1 et 2 Déterminer si le mutant NHP2-X154R est présent dans les RNP H/ACA matures et fonctionnelles in vivo (hTR et autres RNA H/ACA). Vérifier si le mutant NOP10-R34W peut former des RNP active (pseudouridylation) avec les RNA H/ACA codant pour des miRNA in vivo (ACA36B et U92), et vérifier si ces miRNA sont toujours générés dans un tel contexte. Tester dautres mutations dans le domaine H/ACA de hTR ou de dérivés de ce dernier sur lassemblage de pré-RNP. Si des miRNA sont effectivement produits, identifier leurs cibles permettrait de mieux connaître limpact des mutations dans NHP2 qui affectent tous les pré-RNP H/ACA.

41 Perspectives 3 e volet Possibilité de combiner une immunopurification de NAF1 la purification par affinité MS2 nest pas suffisante. Utiliser des constructions ayant des séquences 3 flanquantes de plus en plus longues de hTR qui sont transfectées dans des cellules VA- 13, dont lefficacité de maturation serait comparée à celle obtenue dans des cellules HeLa et BeWo par RLM-RACE Produire des ARN synthétiques presque matures oligo-adénylés dans lesquelles le pseudonoeud de hTR est remplacé par 2 petites tiges- boucles ayant une forte affinité pour la protéine MS2. Transfecter des siRNA contre les candidats identifiés en MS dans des cellules VA-13 et procéder au 3 RLM-RACE de hTR. Purifier ces RNP par affinité (agarose-MS2) et identifier des candidats par MS. Incuber ces ARN avec des extraits nucléaires ou les transfecter dans des cellules.

42 Conclusion

43 Remerciements François Dragon, Directeur les membres du laboratoire Yves Henry, CNRS Toulouse. Caroline Martel, assistante de recherche. Chantal Autexier, McGill. Steve Reichow et Gabriele Varani, Université de Washington Kathleen Collins, Berkeley UC. Amed Hossain, étudiant M. Sc.

44 Maturation de snoRNA H/ACA chez S. cerevisiae Grzechnik & Kufel, Mol Cell 2008

45 Transcrits précurseurs de hTR dans des cellules HeLa? 1kb+ RT+ RT- NetGene2 Donor splice sites, direct strand pos 5'->3' confidence 5' exon intron 3' TCACGACAAG^GTAATTCCGT Box et al., Nature 2008 S. pombe

46 Perspectives 3 e volet Utiliser des siRNA contre: RRP6 (accumulation de précurseurs? polyadénylés/oligo-adénylés?) TRF4/5 (perte de loligo-adénylation) PAP1 (perte de polyadénylation) Inhiber le spliceosome (isoginkgetin): Accumulation de long transcrits précurseurs? 3 RLM-RACE en parallèle

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