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Les virus comme vecteurs thérapeutiques Par Patrick Salmon chercheur au Département de Microbiologie et Médecine Moléculaire de lUniversité de Genève.

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1 Les virus comme vecteurs thérapeutiques Par Patrick Salmon chercheur au Département de Microbiologie et Médecine Moléculaire de lUniversité de Genève

2 Parkinson, Huntington Hypercholestérolémie Hémophilie Dystrophies Mucoviscidose Immunodéficiences Anémies Thérapie génique: quelques applications

3 Questions à se poser lorsquon envisage une thérapie génique Ou…

4 What? Where? When?

5 WHAT? Quel produit le gène doit-il exprimer? Quelle est la taille de sa séquence codante? WHERE?Quelles sont les cellules à cibler? WHEN?Combien de temps le transgène doit-il être exprimé? Son expression doit-elle être régulée?

6 MALADIE HEREDITAIRES PathologieDéfaut génétiquePrévalence Cible thérapeutique ImmunodéficienceADA, X-SCIDrare CSH ou lympho T Hémophilie A facteur VIII1: mâles foie, muscle Hémophilie B facteur IX1: mâles CSH, fibroblaste Hyper-cholestérolémie récepteur LDL 1: foie familiale MucoviscidoseCFTR (transporteur1:3.000 cauc. poumon des ions chlores) Hémoglobinopathies: globine 1:600 (éthnie!) CSH anémie falciforme, thalassémie Maladie de Gaucherglucocérébrosidase1:450 (éthnie!) CSH Emphysème héréditaire -1 antitrypsine1:3.500 foie et poumon Maladies candidates pour la thérapie génique

7 Cancer1 million/an aux USA cellules cancéreuses ou dendritiques cellules présentatrices d'antigènes maladies dégénératives: Parkinson 1 million aux USA Alzheimer4 millions aux USA neurones, cellules gliales désordres « immunologiques »: diabète de type Idizaines de millionscellules du pancréas, autres… Cardiovasculaire: resténose, ATS dizaines de millions cellules endothéliales vasculaires maladies infectieuses: SIDA, hépatite B ou Ccentaines de millions CSH, hépatocytes MALADIE ACQUISES PathologiePrévalence Cible thérapeutique

8 Le vecteur idéal - Est défini par les exigences thérapeutiques (expression stable ou transitoire). - Peut atteindre de hautes concentrations permettant linfection de nombreuses cellules. - Est aisément produit par des techniques reproductibles. - Pour l'expression à long terme, est intégré dans un site spécifique du chromosome, ou persiste en épisome stable. - Possède une unité transcriptionelle contrôlable. - Cible certaines cellules spécifiquement. - Est dénué de composants induisant une réponse immunitaire. MAIS: un vecteur moins-que-parfait sera souvent adéquat...

9 Vecteur Vecteur Cellules Cellules Génétiquement Modifiées Isolation Transplantation Injection Thérapie génique: in ou ex? In vivoEx vivo

10 Vecteurs pour la thérapie génique Viraux adénovirus virus adéno-associé (AAV) rétrovirus: oncorétrovirus lentivirus virus herpes virus à ARN (polio, sendaï, etc…) Non viraux ADN nu liposomes

11 Vecteurs viraux

12 Vecteurs viraux

13 Trois familles de virus utilisés pour le développement de vecteurs AAV AdénovirusRétrovirus

14 Adénovirus OOOOH… Ne sintègre pas Immunogénique (moins si « éviscéré ») Peut induire une « acute phase response » AAAH! Grande capacité (30-40 kb) Facile à produire à hauts titres Infecte les cellules non-mitotiques Non-enveloppé Génome: ADN Taille: nm

15 AAV OOOOH… Faible capacité (4 kb) Difficulté de production (« dependovirus! ») LE VECTEUR sintègre au hasard Immunogénicité conditionnée par la contamination par le virus helper AAAH! Infecte les cellules non-mitotiques LE VIRUS sintègre à un site spécifique Non-enveloppé Génome: ADN Taille: nm

16 Retrovirus OOOOH… Sintègre au hasard Ninfecte pas les cellules non-mitotiques (ONCORETROVIRUS) AAAH! Capacité raisonnable (10 kb) Facilité de production adéquate Infecte les cellules non-mitotiques (LENTIVIRUS) Sintègre Pas de transfert de séquences codantes virales Enveloppé Génome: ARN-ADN Taille: nm

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18 Cycle de réplication du HIV Maturation Attachement Fusion decapsidation Retro- Transcription Import Nucléaire Intégration Transcription Export Nucléaire Assemblage bourgeonnement Modifications Post-traductionnelles Synthèse Proteines CCR5 CXCR4 CD4

19 Transduction par vecteur lentiviral Fusion / Décapsidation Rétro-Transcription Import Nucléaire Intégration Endocytose Attachement Expression

20 Quelques dates marquantes… 1996: Un vecteur lentiviral peut effectuer le transfert, lintégration et lexpression à long terme un gène dans les neurones in vivo. 1998: Transduction stable de CSH humaines capables de reconstituer des souris NOD/SCID. 2000: Traitement de la mucopolysacharidose, du Parkinson et de la thalassemie dans des rongeurs. 2002: transgenèse avec vecteur lentiviral. 2003: Premier essai clinique avec un vecteur lentiviral.

21 1e génération 2e génération 3e génération Génome HIV-1 TAT REV CMV polyA TAT REV CMV polyA RSV polyA REV VIF VPRVPU NEF TAT REV VIF VPRVPU NEF LTR GAG POL GAG POL GAG POL GAG POL Plasmides dempaquetage lentivecteurs: polyA

22 gag pol env éléments actifs en cis LTR dPPT Capacité: 10 kb RRE tat nef vpr vif vpu rev SD SA Vecteur de transfert cPPT RRE cPPT rev LTR dPPT

23 Prototypes de lentivecteurs Inductible Ubiquiste Gene X EF1-a cPPT RRE Gene X gp91 phox cPPT RRE Gene X Tet-O cPPT RRE Gene X cPPT RRE Gene Y Bicistronique Gene X cPPT RRE U6 sihRNA U6 sihRNA Inhibiteur Spécifique WPRE SIN WPRE SIN WPRE SIN WPRE SIN

24 Production de lentivecteurs CMV RSV AnAn GAG POL AnAn REV CMV AnAn VSV G 50 TU/cellule x jour 293T WPRE Gene X LTR cPPT RRE LTR

25 Dox 30 TU/cellule x jour Lignée stable productrice de lentivecteurs WPRE Gene X LTR cPPT RRE LTR CMV Tet AnAn GAG POL AnAn REV Tet AnAn VSV G

26 Titration dun vecteur lentiviral 1.Décompte des particules: p24-CA 2.Décompte des génomes: real-time QPCR 1.Titration provirale: real time QPCR 2. Expression du trangène: FACS, etc…

27 Applications

28 Hepatocytes comme cibles de thérapie génique Pour le traitement de maladies hépatiques Crigler-Najjar type I (Bilirubine UDP-Glucuronosyl transferase) Tyrosinémie héréditaire type I (Fumaryl acetoacetate hydrolase) Hyperammoniémie (Ornithine transcarbamylase) Maladie de Wilson(ATP 7B) Hépatite viral B ou C (Immunisation intracellulaire) Comme site de production de protéines systémiques Maladies génétiques hépatiques Emphysème (alpha-1 Antitrypsine) Hémophilie A,B (Facteur VIII, Facteur IX) Trouble du métabolisme lipidique(Apolipoprotéines) Maladies génétiques non-hépatiques Diabète type I (Insulin, PDX-I) Mucopolysaccharidose (alpha-L-Iduronidase) Thalassémie (Erythropoiétine)

29 Hypercholestérolémie homozygote familiale (récepteur low-density lipoproteins -LDL-) Récolte Purification des hépatocytes Lobectomie 20% Réimplantation Transfert de gène Culture

30 5 wks 1% 50% hepatectomy x100 x200 31% 0.02% GFP FL2 1% 2 wks x100 x200 70% hepatectomy 2x10 7 hep. Gfp-LV, moi 10, with vit E

31 CSH Précurseur myeloide Précurseur érythroide Précurseur Lymphoide Neutrophiles, monocytes Lymphocytes Erythrocytes Migration(transdifferenciation?)

32 CSH Précurseur myéloide Précurseur érythroide Précurseur lymphoide Neutrophiles, monocytes Lymphocytes T Erythrocytes IL-7 IL-15 IL-7 IL-15

33 Il-7 et homéostase des lymphocytes T IL-7R c Y Y P P JAK1 JAK3 Cyt C Bcl-2 Bcl-X Bad PI3-K Anti-apoptose STAT3 STAT5a STAT5b Pro-differenciation P-Bad IL-7

34 CSH Précurseur lymphoide Lymphocytes T X-SCID IL-7 IL-15 IL-7 IL-15

35 Transduction CSH Génétiquement Modifiées Isolation des CSH Transplantation Thérapie génique des « enfants bulles » Chaîne ILR LTR

36 Thérapie génique X-SCID Vecteur: MLV (oncorétrovirus) Cibles: ~ 2x10 8 cellules CD34 + activées Efficacité de transduction: ~ 30% Fraction de cellules sanguines positives pour le transgène: - lymphocytes T: ~ 100% - neutrophiles: ~ 0.1% Chaîne ILR LTR

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40 Transgène LTR Promoteur Oncogène Effet promoteur Effet enhancer Oncogenèse par intégration

41 Promoteur LMO2 Leucémie post-thérapie génique X-SCID Chaîne ILR LTR Exon 2 Exon 4 Exon 3 Exon 5 Exon 1

42 IL-7 IL-15 IL-7

43 Thérapie génique X-SCID 11 enfants traités 1 sans réponse 2 leucémies (1 rémission, 1 rechute) 8 à la maison avec une vie normale

44 Thérapie génique SCID-ADA 4 enfants traités 4 enfants guéris

45 Conclusion: les vecteurs viraux peuvent être thérapeutiques, MAIS …

46 Quelques axes de recherche en thérapie génique - vectorologie (ex: ciblage) - toxicologie (ex: oncogenèse) - immunologie (ex: tolérization) - développement de modèles

47 Intégration des vecteurs rétroviraux Promoteur Exon 1 Exon 3 Exon 2 Exon 4 MLV HIV

48 Intégration ciblée Promoteur Exon 1 Exon 3 Exon 2 Exon 4


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