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Réaction antigène - anticorps. L'immunologie Est la branche de la biologie qui s'occupe de l'étude du système immunitaire. Les réactions de défense de.

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1 Réaction antigène - anticorps

2 L'immunologie Est la branche de la biologie qui s'occupe de l'étude du système immunitaire. Les réactions de défense de l'organisme face à un organisme pathogène- quelle que soit la nature de celui-ci, virus, bactérie, champignon ou protozoaires, les maladies auto-immunes, les allergies et le rejet des greffes forment l'aspect médical de cette science.greffes

3 Antigène Un antigène est une macromolécule naturelle ou synthétique, reconnue par des anticorps ou des cellules du système immunitaire et capable d'engendrer une réponse immunitaire. Les antigènes sont généralement des protéines.macromolécule

4 Anticorps Un anticorps est une protéine complexe utilisée par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les antigènes de manière spécifique. Les anticorps sont sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B les plasmocytes.

5 Anticorps Les anticorps constituent l'immunoglobuline principale du sang, aussi on utilise parfois le terme immunoglobuline à la place du mot anticorps, mais cet emploi est abusif. Dans le cas de maladies auto-immunes, on parle d'auto-anticorps

6 Rôle des anticorps Au cours de la réponse immunitaire, les anticorps ont trois fonctions principales : se lier à l'antigène, activer le système du complément et recruter des cellules immunocompétentes.

7 Les réactions antigène-anticorps Les réactions antigène-anticorps sont utilisées dans le laboratoire de Microbiologie soit pour l’identification antigénique (à l’aide d’un sérum qui contient des anticorps connus), soit pour le diagnostique sérologique pour la mise en évidence (qualitatif) ou pour le titrage (quantitatif) d’anticorps ( à l’aide d’un antigène connu).

8 Les réactions antigène-anticorps

9 Il existe de nombreuses techniques de détection des anticorps: Précipitation en milieu liquide ou en milieu solide Agglutination passive Fixation du complément Inhibition de l'hémagglutination Neutralisation (d'une propriété de l'antigène) Immunofluorescence Immuno-enzymologie (ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay) –ELISA indirect –ELISA sandwich –ELSA compétition Western-blot Radio-immunologie (en particulier pour les dosages hormonaux)

10 Techniques La plupart de ces techniques utilisent les propriétés des anticorps monoclonaux. Leur affinité et leur spécificité de liaison à leur cible fait d'eux des outils incontournables de détection. Ils permettent de déterminer la présence d'un épitope particulier dans un échantillon, permettant ainsi dans les techniques comme le western blot ou l'ELISA de détecter des protéines, ou des modifications particulières de protéine (phosphorylation, acétylation, etc.).

11 Les réactions antigène-anticorps La réaction d’agglutination – est une réaction antigène-anticorps (Ag-Ac) d’agrégation où l’antigène est représenté par des cellules bactériennes en suspension et c’est un antigen particulé. Les immuns complexes Ag-Ac forment des réseaux tridimensionnels.

12 Les réactions antigène-anticorps La réaction d’agglutination sur la lame donne des relations d’ordre qualitatif, d’orientation, tout en mettant en évidence une correspondance entre le sérum utilisé (les anticorps) et l’antigène à identifier.

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14 La réaction d’agglutination dans les tubes L’agglutination O ou somatique est donnée par l’antigène O ou somatique qu’il se trouve dans la structure de la paroi cellulaire. L’agglutination H ou flagellaire est donnée par l’antigène H de nature protéique (la flagelline) qu’il est présente chez les bactéries mobiles

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16 La réaction d’agglutination en tubes sont: - La réaction de Widal pour le diagnostique dans les fièvres typho- paratyphïdiques - La réaction de Wright dans la brucellose - La réaction de Weil-Felix pour le diagnostique du typhose exanthématique.

17 L’agglutination passive Ou l’agglutination sur un support, est utilisée quand l’antigène est une solution moléculaire et sa fixation sur un support particulé lui confère l’agglutinabilité dans la prétendu sérum immun. On peut utiliser des différentes particules: latex, le polystyrène, la bentonite, le collöide.

18 Exemples de réactions d’agglutination passive Le test au latex est utilisé pour la mise en évidence des antigènes chez le Haemophylus, chez le pneumocoque et chez le méningocoque (en LCR, en sérum, dans la sécrétion pharyngienne) ou pour la mise en évidence d’anticorps anti-ADN dans le diag. de lupus érythémateux disséminé où les particules de latex sont couvertes d’ADN

19 Exemples de réactions d’agglutination passive Les réactions avec l’Ag adsorbé sur les particules inertes: le test au latex ( facteur rhumatoïde ou FR) a lieu sur la lame en verre ou en tube On trouve le FR dans les 80% des cas de polyarthrites rhumatoïdes.

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21 La réaction de précipitation Est une réaction Ag-Ac d’agrégation où l’antigène est représenté par les macromolécules en solution colloïdale. Les complexes Ag-Ac précipitent quand leurs éléments participants ( l’antigène et l’anticorps spécifique ) se trouvent dans une proportion optimale.

22 La réaction de précipitation en gel Un élément (l’Ag ou l’Ac) ou les deux éléments ( l’Ag et l’Ac ) peuvent diffuser dans le gel d’agar ou d’agarose. La diffusion simple: où soit l’Ag ou soit l’Ac peut diffuser dans le gel d’agar et l’autre élément est introuit en gel.

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24 La diffusion en champ électrique L’immunoélectrophorèse – faire l’association entre le principe de l’électophorèse en gel d’agar et la diffusion en gel. On prépare une plaque en verre avec le gel d’agar.Après sa solidification on fait une fosse centrale et deux godets périphériques.Les antigènes sont mis dans les godets. On mets en marche l’élecrophorèse et les antigènes complexes se séparent. Dans la 2-ème étape on met dans la fosse centrale le sérum qui contient les anticorps et on laisse les réactants pour diffuser. La correspondance entre les antigènes et les anticorps fait apparaître les arcs de précipitation qu’ils sont éloignés l’un d’autre.

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26 La réaction de fixation du complément ( RFC) La RFC est une réaction antigène (Ag) – anticorps (Ac) avec la participation du Complément ( C‘ ). Cette réaction peut être utilisée dans le diagnostique direct pour l’identification d’un microorganisme et dans le diagnostique sérologique pour la mise en évidence des anticorps spécifiques.

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29 La réaction de fixation du complément ( RFC) Dans les RFC quantitatives, on peut déterminer le titre de la réaction qu’il est donné par la plus grande dilution du sérum en recherche où il y a encore des hématies en suspension ( c’est-à- dire qu’il y a une correspondance Ag-Ac). Dans le cas d’une réaction négative, les complexes Ag-Ac ne se réalisent pas et le C‘ libre se fixe sur le système hémolytique, en se produisant l’hémolyse.

30 ELISA est l'acronyme d'un examen de laboratoire appelé (en anglais) Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, littéralement « dosage d'immunosorption liée à enzyme », c'est-à-dire dosage immunoenzymatique sur support solide. Ce test entre dans le cadre plus général des EIA (enzyme immunoassays), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par une spectroscopie, par opposition aux RIA (Radio ImmunoAssays) dans lesquels l'anticorps est marqué par un radioélément et dont le dosage mesure un nombre de désintégrations par secondes.

31 ELISA L'ELISA est une technique biochimique, principalement utilisée en immunologie, mais pas uniquement, afin de détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon.

32 Un ELISA en sandwich. (1) La plaque est recouverte avec un anticorps de capture; (2) l'échantillon est ajouté, et tout antigène présent se lie à l'anticorps de capture; (3) l'anticorps de détection est ajouté, et se lie à l'antigène; (4) L'anticorps secondaire lié à l'enzyme est ajouté, et se lie à l'anticorps de détection; (5) Le substrat est ajouté et est converti par l'enzyme en une forme détectable (colorée ou fluorescente).

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34 Applications d’ELISA La sérologie est la mise en évidence et éventuellement le dosage d'anticorps spécifiques. Sérologies virales: VIH, VHB,VHD, VHC,VHA,CMV,rubéole, VEB etc. Sérologies parasitaire:Toxoplasmose

35 La réaction d’immunoflorescence (RIF) Les colorants fluorescents en vert les plus connus sont des dérivés de la fluorescéine comme le FITC ( Fluorescéine Iso Thio Cyanite). RIF (la méthode directe) est une réaction où l’antigène se lit spécifiquement d’anticorps qu’ils sont préalablement couplés avec des substances fluorescentes (FITC) et il devient visible par l’examen microscopique dans la lumière ultraviolette.

36 La réaction d’immunoflorescence

37 Le Radioimmunotest (RIT) RIT est une métode très sensible et spécifique, qui consiste dans le marqueage de l’Ag ou de l’Ac par une substance radioactive [ Iod(125), C(14), H(3) ], suivie d’une mesure de la radioactivité du complexe formé.

38 Le Radioimmunotest (RIT) La réaction est utilisée pour la mise en évidence de l’entérotoxine staphylococcique, de la toxine botulinique de type A, du polysaccharide capsulaire chez les pneumocoques et chez le Pseudomonas aeruginosa et les infection virales ( le diagnostique d’infection grippale, d’infection avec le poxvirus, le diagnostique de l’hépatite B).

39 Western Blot Western blot ou immunoblot, est une méthode de protéomique, ayant recours à la biologie moléculaire, la biochimie et l'immunogénétique, pour détecter une protéine spécifique dans un échantillon donné d'extrait ou d'homogénat tissulaire. La technique utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour séparer les protéines, préalablement dénaturées, selon leur masse. Les protéines sont ensuite transférées depuis le gel sur une membrane (nitrocellulose), où elles sont exposées à un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt.

40 Western Blot Il est possible grâce à cette technique de détecter la présence d'une protéine dans un tissu, d'évaluer sa taille, sa concentration, les variations de cette concentration, effectuer des comparaisons de concentrations entre différents groupes, etc.

41 Applications médicales en diagnostic Les tests VIH de confirmation emploient la méthode du buvardage de western afin de détecter un anticorps anti- HIV dans un échantillon de sérum. Des protéines de cellules que l'on sait infectées par le VIH sont séparées et transférées sur membrane comme décrit ci-dessus. Le sérum à tester est appliqué. L'étape d'incubation dans l'anticorps primaire ; les anticorps libres sont éliminés par rinçage de la membrane, et un anticorps dirigé contre les protéines humaines secondaires associé à une enzyme ou un chromophore est ajouté. Les bandes marquées indiquent ensuite les protéines contre lesquelles le sérum du patient contient des anticorps.

42 Applications médicales en diagnostic Certaines formes de détection de la maladie de Lyme utilisent le buvardage de western.

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