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Un modèle pour étudier chez la Drosophile la toxicité induite par Aβ42 de la maladie dAlzheimer A.Finelli, A. Kelkar, HJ. Song, H. Yang, M. Konsolaki Cambridge.

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1 Un modèle pour étudier chez la Drosophile la toxicité induite par Aβ42 de la maladie dAlzheimer A.Finelli, A. Kelkar, HJ. Song, H. Yang, M. Konsolaki Cambridge Céline Pellentz Marianne Simon 06/08, longévité et vieillissement Molecular and cellular neuroscience, 2004

2 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion La maladie dAlzheimer: une brève présentation Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion La maladie dAlzheimer: une brève présentation Stade modéré troubles de la mémoire (noms des proches, évènements récents), difficulté dexpression et de compréhension des mots, désorientation spatiale et temporelle (chez lui, mois, saison…), hallucinations et/ou des délires Stade tardif faiblesses physiques, vulnérabilité à diverses infections (souvent cause de décès), disparition de la mémoire à long terme, expression orale limitée à quelques mots (voire mutisme total), difficultés à se mouvoir, incontinence Durée Environ 10 ans Stade symptomatique Phase non symptomatique Durée Environ ans Stade précoce Perte de la mémorisation, troubles du langage ( périphrases ) et de lorientation spatiale et temporelle, angoisses (voire de dépression) Maladie dAlzheimer maladie neurodégénérative du système nerveux central 60 à 80% des démences chez les plus de 65ans, forme familiale dans 1% des cas 1906 Aloïs Alzheimer décrit des altérations anatomiques observées post-mortem sur une femme atteinte de démence, dhallucinations et de trouble de lorientation

3 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion La maladie dAlzheimer: mécanisme moléculaire et traitements Plaque amyloide Dégénérescence neurofibrillaire Thérapie génique avec le NGF siRNA contre -sécrétase Inhibiteurs de ou -sécrétase -sheet breakers En recherche… Limiter les facteurs de risque Inhibiteurs de canaux NMDA Inhibiteurs de cholinestérase Traitements Vaccin anti-A Chélateur du cuivre Diagnostic précoce (IRM,TEP) En essai clinique

4 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Les modèles de la maladie dAlzheimer Problème non résolu par ces modèles : rôles respectifs de Ab40 etAb42 dans la pathologie ? les singes âgés : troubles cognitifs et de la mémoire, anomalies cellulaires (dépôt d'amylose, anomalie du cytosquelette des neurones) dans le cortex et l'hippocampe Souris transgéniques pour APP, PS1 ou TAU muté plaque amyloïde, dégénérescence fibrillaire, activation des astrocytes. principal modèle MAIS conséquences comportementales difficiles à caractériser, temps et coût C. Elegans : expression de A 42 avec une séquence signal extracellulaire dans le muscle paralysie, plaque amyloïde Intérêt : phénotype rapide, crible génétique possible Drosophile : possède APPL (mais pas la partie A ), -sécrétase mais pas -sécrétase APP humain : problème de développement APP+ -sécrétase : production de peptide A et neurotoxicité Intérêts: peut regarder rapidement les phénotypes (longévité,dégénérescence de lœil, locomotion, mémoire) + peut observer leffet de produits létaux dans loeil

5 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion La création de souches exprimant le peptide Aβ Embryons [yeux blancs] déchorionné stade blastoderme syncitial PA X [yeux blancs] non transfectée Mouche transgénique Pour chaque individu aux yeux pigmentés (souche indépendante) Détermination du chromosome où a eu lieu linsertion (grâce aux chromosomes balanceurs) Établissement de souche homozygote ou hétérozygote Croisements de souche PromoteurSite dexpression TransgèneMarqueurNom des souches GMRŒil A 40 Gène white [yeux pigmentés] Dose dépendant L1 A 42 K1,K3,K52,K53 Ø1 UAS (+elavGal4) neurones A 42 H29.3 C99I8 GFP Injection du plasmide dintérêt avec la transposase [yeux blancs] Transposition dans le noyau dune cellule germinale

6 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Possibilité davoir un phénotype observable aisément? Expression dans lœil pGMR- 42 K3 homozygote Rouge ponceau WB Anti-A Témoin positif Témoin négatif (Plasmide vide pGMR) Augmentation de la dégénération parallèlement à laccumulation de A Mouches exprimant A 42 pGMR-A 42 K1 homozygote pGMR-A 42 K52 homozygote K52/K52

7 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Expression d Aβ42 dans le cerveau 50% % de survie jours UAS-C99 I8 hétérozygote + elavGal4 C155 elavGal4 C155 UAS-A 42 H29.3 hétérozygote UAS-A 42 H29.3 hétérozygote + elavGal4 C155 Longévité en présence dA 42 dans le cerveau Longévité des témoins L expression de A 42 dans le cerveau diminue la long é vit é des Drosophiles

8 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Des « phénotypes » semblables à la pathologie humaine Aβ42 sagrège à lextérieur des cellules extraits protéiques de tête de mouches GMR-Aβ 42 K3 – Western Blot ponceau La majorit é des peptides Aβ42 présents dans la tête des Drosophiles est sous forme insoluble Test Elisa de la présence dAβ dans le surnageant de cellules de Drosophiles transfectées par UAS-Aβ40. Le peptide Aβ40 - et donc sans doute Aβ42 (même séquence signal) - est sécrété par les cellules lexprimant

9 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Des « phénotypes » semblables à la pathologie humaine La sévérité du phénotype est fonction de la dose dAβ42 agrégé immunomarquage du peptide Aβ42 sur des cryosections horizontales dœil de Drosophile adultes (4-5 jours). corrélation quantité de peptide / degré de désorganisation? wt Aβ 42 K10 témoin Aβ 42 K3 homozyg Aβ 42 K10 homozyg L intensit é du ph é notype croit avec la quantit é de peptide accumul é Bleu de toluidine

10 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Des « phénotypes » semblables à la pathologie humaine La sévérité du phénotype augmente avec lâge Mouches GMR-Aβ 42 K3 hétérozygotes. Comptage du nombre de mouches dans chaque catégorie phénotypique au cours de lâge. Shift wt/mild -> mild/moderate Plus dévolution après le 32 ème jour La s é v é rit é du ph é notype croit avec l âge, jusqu au 32 è me jour. Ponceau Western Blot dextraits protéiques de têtes de Drosophiles GMR-Aβ 42 K3 à 0-2 ou 35 jours. L augmentation de la s é v é rit é du ph é notype avec l âge doit être due à une accumulation croissante d Aβ

11 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Recherche de gènes modulateurs du phénotype sur ce modèle Sélection dun mutant surexprimant la néprisiline 2000 souches EP dune banque publique (expression des insertions EP dans les cellules où Aβ est exprimé grâce à eyGal4) Souches GMR-Aβ42 23 souches ayant un effet modificateur et nentrainant aucun phénotype au niveau de lœil en absence dAβ Dont un suppresseur du phénotype le plus sévère Nature de cette souche et étude plus précise de son effet sur le phénotype dAβ42 Insert EP inséré en amont du Drosophila neprilysin 2 gene => upregulation de sa transcription L insertion EP entraine une multiplication par 5-6 de l activit é de nep2 Démarche du cribleNature de la souche sélectionnée

12 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Recherche de gènes modulateurs du phénotype sur ce modèle Effet de la surexpression de nep2 sur laccumulation du peptide Aβ42 Nep2 code une protéase Western Blot dextraits protéiques de têtes de Drosophiles GMR-Aβ42K3 hétérozygotes ou GMR-Aβ42K3 hétérozygotes ; EP(3)3549nep2 Ponceau La surexpression de nep2 entraine une diminution de l accumulation de peptide Aβ42 Effet de la surrexpression de nep2 sur le phénotype durée de vie Coexpression dans le SNC induite par Gal4 de Aβ 42 H29.3 et de nep2 La surexpression de nep2 att é nue le ph é notype « raccourcissement de la dur é e de vie » 50% témoin

13 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Bilan: La Drosophile, un bon modèle… Un modèle plutôt fidèle à la pathologie humaine, au moins au niveau moléculaire. Permettant une caractérisation phénotypique aisée Sur lequel on peut mettre en œuvre des outils efficaces Doù de possibles réponses aux questions que lon peut poser à un tel modèle Aβ sous forme doligomères insolubles et de plaques extracellulaires Aβ42 semble être sécrété et être retrouvé sous forme insoluble Oligomères responsables de la neurotoxicité Phénotype croissant avec la quantité dAβ accumulé Symptômes à évolution progressive La sévérité du phénotype saccroit avec lâge. Toxicité dAβ pour les photorecepteurs => phénotype très marqué dans lœil Toxicité pour les neurones du SNC mesurable par la diminution de la durée de vie Crible de gènes modulateurs, ici par banque gain de fonction Identification dun gène connu en modèle Souris Relation entre agrégation dAβ et toxicité? Cible cellulaire de la toxicité dAβ? Réponse cellulaire à Aβ? Pourquoi la pathologie AD est elle âge-dépendante? Quel est le mécanisme de la toxicité médiée par tau? Link, 2005

14 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion … Mais avec ses limites Un modèle qui ne pourra pas tout expliquer Maladie dAlzheimer = maladie complexe, origines variées Ne modélise que la cascade amyloïde (implication de tau) Des différences au niveau moléculaire même qui peuvent mettre en doute les conclusions Homologue Appl dAPP na pas de domaine Aβ-like. Pas dactivité β-sécrétase. Présence des intervenants du mécanisme moléculaire chez lhomme? Aβ40 présent dans les plaques amyloïdes Instable dans le modèle, même en présence de peptide Aβ42. Bon mod è le pour les premi è res é tudes des m é canismes mol é culaires (cribles impossibles chez un mammif è re) Mais tous les r é sultats sont à v é rifier en mod è le Mammif è re = garder en m é moire que ce n est qu un mod è le

15 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Analyse critique Des méthodes expliquées un peu succinctement (Ponceau), comme la caractérisation des souches. Des changements de souche étudiée rendant parfois linterprétation un peu « hasardeuse » Ex: étude de la sévérité des phénotypes en fonction de la quantité de peptide accumulé, -Immunomarquage dAβ sur des coupes dyeux homozygotes pour Aβ 42 K3 ou Aβ 42 K10 -observation de lorganisation des ommatidies dans des souches Aβ 42 K3 hétérozygotes et homozygotes ou Aβ 42 K52 hétérozygotes. Étude de la sécrétion du peptide Aβ40 au lieu du peptide Aβ42. -> Même séquence signal mais comportement très différent -> Aβ42 a une séquence signal clivée dans la mouche mais chez le C. elegans Aβ saccumule DANS les cellules bien que sa séquence signal soit clivée (Link 1995)

16 Présentation du sujet et Problématique Les expériences et résultats Synthèse Conclusion Utilisations ultérieures du modèle Perspectives Ce modèle a été utilisé pour des tests : De mémoire (olfaction) De locomotion De survie Laccumulation de A 40 ou A 42 peut altérer la mémorisation MAIS seule A 42 est capable de faire des plaques amyloïdes, de provoquer la dégénérescence des neurones, de causer des problèmes locomoteurs et enfin une mort prématuré. (Liima and al. 2004) Ce modèle de Drosophile peut servir de crible pour trouver des pistes thérapeutiques ciblant les plaques amyloïdes et leurs conséquences.

17 BONUS

18 Le modèle UAS-Gal4

19 hypothèse de la cascade amyloïde


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