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Virus recombinant et vaccination Exemple de la rage FLICOTEAUX Pascal GARCON Sylvain.

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1 Virus recombinant et vaccination Exemple de la rage FLICOTEAUX Pascal GARCON Sylvain

2 Rhabdovirus 4 RNA monocat-, Kb 4 Une seule glycoprotéine: G

3 Principe 4 Le but est dinsérer le gène codant pour la glycoprotéine rabique dans un virus (virus de la vaccine) 4 Lensemble est injecté, la glycoprotéine est expriméeimmunisation

4 Préparation de linsert 4 Etape 1: excision de la queue polydG Oligonucléotide double brin ATG TAC ATG TAC ATG= codon initiateur

5 Préparation de linsert 4 Etape 2: correction de laa n°8 Préparation de linsert ATG TAC ATG TAC CTA GAT CCA GGT CCA GGT Hind III

6 Préparation du plasmide Hind III tk clonage Gène Thymidine kinase ADN viral

7 Préparation du plasmide tk + + Promoteur précoce insert Tk - Hind III

8 Production de virus recombinant Insert Géne nts Virus vaccinal ts Culture de cellule Ca 2+ Ts = thermosensible, nts = non ts

9 Sélection des recombinants 4 Incubation à température non permissive Culture de cellule Recombinants nts

10 Sélection des recombinants 4 Culture sur cellules tk - Culture de cellule + BrdUrd Recombinants nts et tk- BrdUrd = substrat tk

11 Vérification 4 Digestion ADN par Hind III 4 Electrophorèse: –2 fragments (1,1 + 5,5 Kb): OK –Si 1 fragment (4,6 Kb): non recombinant 4 Southern blotting: hybridation avec DNA de la glycoprotéine rabique

12 Préparation du plasmide tk + + Promoteur précoce insert Tk - Hind III

13 Essais in-vitro 4 Infection cellules tk- 4 Forte immunofluorescence avec des Ac anti-gp 4 La synthèse est donc efficiente 4 Immunoprécipitation: par sérum polyclonal autant que par 2 Ac monoclonaux (bande à PM de 66000: correspond à la glycoprotéine rabique)

14 Essais in-vivo 4 Injection intra-dermique chez la souris: résiste à des épreuves dinfection à haute dose

15 Conclusion 4 La glycoprotéine produite est qualitativement indistingable de la protéine native 4 Les virus atténués comme le virus vaccinal sont des vecteurs particulièrement appropriés pour la production de vaccins (à été utilisé pour smallpox, hépatite B, influenza et herpès)

16 Biblio 4 Kieny M.P. et al., 1984 : expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. Nature, 312, Blancou J. et al., 1986 : oral vaccination of the fox against rabies using a live recombinant vaccinia virus. Nature, 322, Pastoret P.P. & Brochier B., 1996: the developement and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiol. Infect., 116,


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