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Etude de la variabilité du potentiel protéolytique de paroi chez Streptococcus thermophilus Caractérisation de la variabilité du gène prtS Sous la direction.

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1 Etude de la variabilité du potentiel protéolytique de paroi chez Streptococcus thermophilus Caractérisation de la variabilité du gène prtS Sous la direction Pr. Annie DARY et Dr. Clarisse PERRIN Wessam GALIA Ecole Doctorale RP2E 15 janvier 2009 L'équipe Domestication en aquaculture continentaleDomestication en aquaculture continentale L'équipe Micropolluants & résidus dans la chaîne alimentaireMicropolluants & résidus dans la chaîne alimentaire L'équipe Protéolyse & biofonctionnalités des protéines et des peptidesProtéolyse & biofonctionnalités des protéines et des peptides

2 Production de peptides bioactifs Le peptide bioactif dorigine alimentaire : ne répond pas seulement aux besoins nutritionnels joue un rôle bénéfique chez le consommateur -rôle anxiolytique ou anti hypertensif...

3 Production de peptides bioactifs issus du lait Les protéines du lait renferment dans leur séquence une grande variété de peptides potentiellement bioactifs : par protéolyse in vitro ajout à laliment directement dans lorganisme générés par des protéases endogènes 2 % des gènes humains codent pour des protéases ou des inhibiteurs de protéases pendant la fabrication / transformation de laliment (fermentation, affinage) générés par des bactéries lactiques (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus..)

4 Production de peptides bioactifs par voie microbienne Mieux comprendre le potentiel protéolytique dune bactérie lactique : Streptococcus thermophilus Caractérisation du potentiel protéolytique –Caractériser les différents acteurs du système –Caractériser sa variabilité au sein de lespèce St. thermophilus dans le but de sélectionner des souches capables de libérer des peptides bioactifs.

5 Présentation de Streptococcus thermophilus Une des bactéries lactiques les plus utilisées dans lindustrie des ferments (du lait) Homofermentaire et se développe entre 37 et 42°C Appartient au genre Streptococcus Non pathogène Séquençage complet de 3 génomes a révélé : - labsence des gènes de virulence - une faible variabilité de séquence Bolotin et al., Nature Biotechnology (2004) 22:

6 Variabilité phénotypique chez St. thermophilus Variabilité phénotypique affecte différents caractères tels que : - morphologie des colonies, - taille des chaînettes, - résistance à différents stress, - vitesse de croissance et dacidification du lait

7 Système protéolytique de St. thermophilus Milieu extracellulaire Paroi bactérienne Cytoplasme Monnet, Bull. Soc. Fr. Microbiol (2006) 21:23-28

8 CW M C Cell Wall Membrane Cytoplasme Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406 Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques

9 CW M C Cell Wall Membrane Cytoplasme Prédomaine (signal+proséquence) PP PR Domaine catalytique A A A A A ? W W W W W Espaceur Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406 Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques

10 CW M C Cell Wall Membrane Cytoplasme H H H Positionnement de A et B AN Ancrage AN Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406 Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques

11 Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385 Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après maturation Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisines Capable dhydrolyser les caséines S1 et Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de carence azotée Régulation du gène prtS est inconnue Fernandez-Espla et al., AEM (2000)

12 Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385 Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après maturation Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisines Capable dhydrolyser les caséines S1 et Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de carence azotée Régulation du gène prtS est inconnue Fernandez-Espla et al., AEM (2000) Activité protéolytique de surface retrouvée uniquement chez quelques souches Shahbal et al., AEM (1993)

13 Démarche expérimentale Evaluer la variabilité génétique dune collection de souches de St. thermophilus Evaluer la variabilité du potentiel protéolytique de surface de St. thermophilus

14 Gène ARNr 16SGène ARNr 23S ITS 16S-23S ITS-I AAGGCCAAAAATAA ITS-III T... ITS-IV...A ITS-V...A......T... ITS-II Consensus t... Mise en évidence dun nouveau type ITS-V Génotypage de souches de St. thermophilus Séquençage de la région Internal Transcribed Spacer 16S-23S ITS-I AAGGCCAAAAATAA ITS-III T... ITS-IV...A ITS-V...A......T... ITS-II (Galia et al., 2009)

15 Génotypage de souches de St. thermophilus Mise en évidence dune variabilité génétique au sein de la collection de souches de St. thermophilus

16 Variabilité du système protéolytique de surface Détermination de lacidité Dornic (acide lactique produit) permet dévaluer la croissance dune souche en milieu lait Présence de la protéase de surface Forte croissance = fort pouvoir acidifiant Absence de la protéase de surface Faible croissance = faible pouvoir acidifiant

17 Variabilité du système protéolytique de surface ? Variabilité du système protéolytique de surface 12 Souches à fort pouvoir acidifiant 53,4 ± 4,5°D 2 Souches à faible pouvoir acidifiant 11,0 ± 2,4°D 16 Souches à moyen pouvoir acidifiant 29,8 ± 4,2°D après 6 h de croissance en lait (° Dornic)

18 Variabilité du système protéolytique de surface Recherche du gène prtS 800 pb 11/16 souches posséderaient le gène prtS 12/12 souches posséderaient le gène prtS 5/16 souches ne possèdent pas le gène prtS 2/2 souches ne possèdent pas le gène prtS Souches à fort pouvoir acidifiant Souches à faible pouvoir acidifiant Souches à moyen pouvoir acidifiant

19 Variabilité du système protéolytique de surface Recherche de lactivité de la protéase PrtS par zymographie PB18o PrtS CNRZ1066 LMD9

20 Variabilité du système protéolytique de surface Recherche de lactivité de la protéase PrtS par zymographie pour toutes les souches PrtS Pouvoir acidifiant Nombre de souches Faible 2 Moyen 5 Moyen 8 Moyen 3 Fort 12 Présence du gène prtS Activité protéolytique

21 Pourquoi ? Gène prtS muté Gène prtS non exprimé Séquençage du gène prtS chez : -4 souches à moyen pouvoir acidifiant (prtS + PrtS - ) -3 souches à fort pouvoir acidifiant (prtS + PrtS+) Comparaison de séquences : -100% identiques entre elles et avec la souche LMD-9 -95% identiques avec la souche CNRZ385 Variabilité de lactivité protéolytique de surface

22 Variabilité du système protéolytique de surface Séquençage du gène prtS : SS PP PRA H W AN PB18o ou LMD CNRZ PB18O OU LMD9 60 SESPVAEELVDTSVEATSTDVTTTDNEEETLGSESPVVEELVDTSVEATPTDVTTTDNVEETLGSE 126 CNRZ SESPVVEELVDTSVEATSTDVTTTDNEEETPGSE 94 PB18o ou LMD9 720 VQNGLITLAPRLLAEIPGGKVTVQ 743 CNRZ AQKRIDHLGSTSISRDSWRKVTVK 711 fonction inconnue PB18o ou LMD9 936 SGNKNFYSGDP 946 CNRZ SGDKNIYSGNP 914 Région fixation du substrat PB18o Moyen pouvoir acidifiant LMD9 Fort pouvoir acidifiant

23 Variabilité du système protéolytique de surface Séquençage du gène prtS : PB18o ou LMD9 936 SGNKNFYSGDP 946 CNRZ SGDKNIYSGNP 914 Région fixation du substrat PB18o Moyen pouvoir acidifiant LMD9 Fort pouvoir acidifiant

24 Conclusion Variabilité du système protéolytique de surface Pouvoir acidifiant Gène prtSActivité caséinolytique Fortes12/1212 Moyennes11/163/16 Faibles0/2 Variabilité affecte la régulation du gène - Variabilité en terme de présence / absence du gène prtS - 2 allèles prts différents ont été mis en évidence chez S. thermophilus

25 Perspectives : - Etude de la régulation du gène prtS entre - les souches qui ont le gène et qui lexpriment fortement - et les souches qui ont le gène et qui lexpriment peu ou pas.


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