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OPTION EQUINE II – SYSTEME DIGESTIF 1 - PATHOLOGIES BACTERIENNES 2 – APPROCHE DIAGNOSTIQUE Annick Linden Service de Bactériologie Dpt. des Maladies Infectieuses.

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1 OPTION EQUINE II – SYSTEME DIGESTIF 1 - PATHOLOGIES BACTERIENNES 2 – APPROCHE DIAGNOSTIQUE Annick Linden Service de Bactériologie Dpt. des Maladies Infectieuses et Parasitaires

2 DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né 2. Poulain 3. Adulte 4. Diarrhées induites par les ATB

3 DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né- E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique - Clostridium sp 2. Poulain- Salmonella sp - Clostridium sp - Rhodococcus equi - E coli - Campylobacter - Streptococcus durans - Bacteroides fragilis 3. Adulte- Salmonella sp - Clostridiose - Colitis "X" - Potomac Horse Fever 4. Diarrhées induites par les ATB

4 CAUSES INFECTIEUSES RESPONSABLES DE MORT BRUTALE (< 24 H) CHEZ LE CHEVAL Shaker-foal syndromeClostridium botulinum (type B) Hépatite chez le poulainClostridium piliforme (Tyzzer’s disease) Septicémies néonatalesActinobacillus equuli E coli, Salmonella sp Septicémies chez l’adulteBacillus anthracis, … EntérotoxémiesClostr perfringens, difficile, sordellii Myopathies d’origine clostridienneClostr septicum, chauvoei, novyi,perf, Colite aiguë et csqNeo risticii, Salmonella sp Colitis « X »Clostridium sp Hémorragie poches gutturalesMycose

5 DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES Nv-né- Septicémie : E coli, Actinob. sp, Salm - Clostridium sp 1 – Actinobacillus equuli " Maladie du poulain triste " (avt : Shigellose du poulain) Changements récents dans la taxonomie Actinobacillus equuli subsp equuli Actinobacillus equuli subsp haemolyticus (taxon 11 de Bisgaard) Coccobacilles Gram nég, aéro-anaérobies coloration bipolaire, immobiles, non sporulés gélose au sang, 5 % CO2 A equuli equuli : col visqueuses, adhérentes, non hémo A equuli haemolyticus : hémolytiques

6 Actinobacillus equuli equuli Bactéries commensales muqeuses (Resp et Dig) des chevaux ---- Pathogènes opportunistes Souches flore normale = Souches isolées de lésions A. equuli equuli : Cv (poulain, adulte), porc A. equuli haemolyticus : que chez les chevaux (poulain, adulte) Actinobacillus sp

7 Contexte de septicémie : transfert immunité passive ?  Début brusque : H  Poulain fort abattu, refuse de têter  Fièvre n’est pas constante  Diarrhée et troubles respiratoires  Articulations douloureuses  Arthrites fréquentes si survie  Tableau parfois discret (cfr MIGA) : diagnostic précoce difficile Septicémies néonatales chez le poulain : Actinobacillus sp est une cause de mortalité fréquente Actinobacillus sp

8 DIAGNOSTIC ANTE MORTEM Diagnostic précoce = ttm précoce = meilleur pronostic Clinique « Score septique » : WBC, fibrinogène, glycémie, IgG Hémocultures : OK en théorie mais : matériel adéquat plusieurs hémocultures nécessaires/24h risque de faux négatifs interprétation des résultats H pour avoir les résultats DIAGNOSTIC POST MORTEM Lésions macro Prélèvements de choix : reins, poumons Diagnostic précis : confusion possible avec Pasteurella Actinobacillus sp

9 Traitement (Actinobacillus sp) Péni-Genta TMP/S Céphalosporines III G Etude en Suède 97 % des souches Act sensibles àTMP/S 92 %Ampi 90 %Péni 85 %Genta 49 %Strepto Prévention Pas de vaccins commerciaux Mesures d'hygiène (accouchement), colostrum ! Actinobacillus sp

10 DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né- E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique - Clostridium sp 2. Poulain- Salmonella sp - Clostridium sp - Rhodococcus equi - E coli - Campylobacter - Streptococcus durans - Bacteroides fragilis 3. Adulte- Salmonella sp * - Clostridiose * - Colitite "X" - Potomac Horse Fever * Diarrhées induites par les ATB

11 2 - Clostridium sp  Clostridium tetani  Clostridium botulinum  Clostridium perfringens  Clostridium sordellii  Clostridium difficile  Clostridium cadaveris Sphère Digestive

12  Toxines majeures   1  2     Toxines mineures Clostridium perfringens Bâtonnets réguliers Gram +, anaérobies, sporulés

13 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Photos

14 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Photos

15 Clostridium perfringens Poulain : toxinotypes B et C Adulte : toxinotype A  entérotoxine A+---+/- B C+ --- D+- -- E+--+-

16 5 DIFFERENT TOXINOTYPES TOXINOTYPES  A+--- B+++- C++-- D+-+- E+--+  N  he Ent MAJOR TOXINS MINOR TOXINS VEGETATIVE PHASE SPORULATION PHASE

17 C. PERFRINGENS C. SEPTICUM C. SORDELLII C. DIFFICILE DIGESTIVE TRACT TOXINS

18 Clostridium sp chez le poulain (1) C. perfringens Type B et C surtout ( toxine  sensible à la trypsine) Susceptibilité du nv-né (absence de protéases intestinales et inhibiteur de trypsine dans colostrum) Sporadique sauf exception Poulain de 1 ou 2 jours Soit mort brutale Soit signes systémiques, diarrhée hémorragique et mort en 2 J Diagnostic - lésionnel : entérite hémorragique nécrosante - bactériologique : aspect quantitatif ! Traitement (cibler surtout déshydratation) - Si ATB: métronidazole (cfr législation), Péni - Probiotiques (compétition de flore : Clostr versus Lactobacillus sp)

19 TOXINOTYPE C (  ) IN NEWBORN ANIMALS Photos

20 TOXINOTYPE C (  ) IN NEWBORN ANIMALS ABSENCE OABSENCE O  TOXIN TRYPSIN SENSITIVE (anti-trypsin activity in colostrum) ABSENCE OF NORMAL INTESTINAL FLORA BRUTAL DIET CHANGES ARE RISK FACTORS

21 TOXINOTYPE C :  + MINOR TOXINS ENTERITIS NECROTICANS IN HUMAN Photo

22 Clostridium sp chez le poulain (2) C. difficile chez des poulains avec/sans ATB poulains de 3 à 5 jours, cas mortels entérite hémorragique nécrosante mise en culture délicate, milieux spécifiques Larges bâtonnets à Gram +, anaérobies stricts, svt mobiles Spores subterminales, ovales et déformantes Bactérie ubiquitaire sols, eaux, flore intestinale, … milieu hospitalier : spores !! désinfectants à base d’hypochlorite TOXINESToxine A (entérotoxine) : cfr diagnostic Toxine B (cytotoxine) Toxine binaire

23 Clostridium sp chez le poulain (2) C. difficile •Nombreux poulains ( < 14 J) sont porteurs de Clostridium difficile !

24 Clostridium sp chez l'adulte 1. Clostridiose intestinale Clostridium perfringens type A, C. difficile, C. cadaveris Dérive de flore – facteurs favorisants (alimentation, stress, ATB..) Fièvre, anorexie, dépression, douleur abdo, diarrhée aiguë Entérite aiguë hémorragique segmentaire (cfr photo) Approche qualitative des Clostridies – recherche des toxines 2. 3.

25  TOXIN = PHOSPHOLIPASE C ATTACKS CELLS MEMBRANE ATTACKS CELLS MEMBRANE CELL DEATH erythrocytes, platelets, leukocytes, endothelial and muscle cells, …

26  toxin Photos

27 A NOVEL TOXIN : B2 TOXIN •NECROTIC ENTERITIS IN PIGLETS (GIBERT ET AL. 1997)  2 PURIFIED FROM C. PERF TYPE C POUR INFO …… Photos

28 B2 TOXIN •PROTEIC MAJOR EXOTOXIN (265 Aa, 28 kDa) •LETHAL FOR MICE AND TOXIC FOR CELLS IN CULTURE •APPARENT PROTEIN INSTABILITY •Cpb2 GENE IS PLASMIDIC (MOBILITY) •C. PERF TYPE A (++), C, D, E, (B)

29 •Cpb2-POSITIVE STRAINS (C.PERF TYPE A) ASSOCIATED WITH ENTERITIS : –IN PIGLETS (GARMORY ET AL, 2000) –IN HORSES (HERHOLZ ET AL, 1999) –IN DOGS (THIEDE ET AL, 2001) –IN CATTLE –….IN ELEPHANT (BACCIARNI ET AL, 2001) CAUSE-AND-EFFECT RELATIONSHIP ?? GENE IS PRESENT BUT TOXIN ??

30 •HIGH LEVEL OF CPB2 + STRAINS IN NEONATAL PIGS WITH ENTERITIS (91.8% VERSUS 11.1 % FROM HEALTHY PIGS) •AND HIGH CORRELATION OF GENOTYPE WITH PHENOTYPE (> 96.9%) (BUESCHEL ET AL, 2003) •HIGH LEVEL OF CPB2 + STRAINS IN HORSES WITH TYPHLOCOLITIS (HERHOLZ ET AL, 1999) •GENOTYPE/PHENOTYPE ? IMMUNOHISTOCHEMISTRY NEEDS FURTHER INVESTIGATION (BACCIARINI ET AL, 2003) PIGS HORSES OK

31 Clostridium sp chez l'adulte 1. Clostridiose intestinale Clostridium perfringens type A, C. difficile, C. cadaveris Dérive de flore – facteurs favorisants (alimentation, stress, ATB..) Fièvre, anorexie, dépression, douleur abdo, diarrhée aiguë Entérite aiguë hémorragique segmentaire (cfr photo) Approche qualitative des Clostridies – recherche des toxines 2. Colite "X" Etiologie non déterminée Forte suspicion d'implication des Clostridies (entérotoxémie) Fort semblable au tableau de clostridiose mais évolution plus rapide Pronostic négatif 3. Clostridiose ATB – induite C. perfringens, C. difficile

32 Clostridium sp chez l'adulte Cas particulier de Clostridium difficile Médecine humaine : principale cause de diarrhée post ATB infection nosocomiale (spores en milieu hospitalier !) Médecine équine : importance croissante de C. difficile ( diagn ++)

33 Clostridium sp chez l'adulte Clostridium difficile Médecine équine : thèse V. Baverud (Suède, 2002) (1) Colites aiguës et fatales chez cv adultes - groupes à risque : cv hospitalisés et traités ATB juments dont poulains traités erythro/rif (2) Exp. Erythromycine induit colite sévère avec prolifération de C.difficile (3) Portage fréquent de C. difficile chez des poulains sains (<15J) réservoirs ? (4) Milieu ext : fermes d’élevage > centres d’entrainement

34 Clostridium sp chez l'adulte Clostridiose ATB – induite Cas particulier de Clostridium difficile Clinique : coliques, diarrhée parfois hémorragique, déshydratation Diarrhée peut débuter pdt ATB ttm ou qques J après Prudence si cas de diarrhée : envrnmt contaminé +++ Lésions : entérite hémorragique nécrosante Diagnostic : prélèvements répétés de MF (1) Mise en culture rapide, milieu sélectif CCFA (Cycloserine Cefoxitin Fructose Agar) (2) Détection toxine : conserver MF à 4°C car dénaturation rapide kits commerciaux Traitement : Métronidazole reste ATB de choix

35 Diagnostic  Clinique : Clostridies : diarrhée (+/-) toxémie  Bactériologique  Anaérobiose  Milieux sélectifs  Comptages !!  si post mortem : délai minimum entre mort de l'animal – prélèvement et mise en culture

36 CLOSTRIDIUM PERF IN HORSES MANAGEMENT IMPROVEMENT SHIFT OF INTESTINAL FLORA RISK FACTORS

37 DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né- E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique - Clostridium sp 2. Poulain- Salmonella sp - Clostridium sp - Rhodococcus equi - E coli - Campylobacter - Streptococcus durans - Bacteroides fragilis 3. Adulte- Salmonella sp - Clostridiose - Colitite "X" - Potomac Horse Fever 4. Diarrhées induites par les ATB

38 3 - Salmonella sp  Réceptivité : poulain nv-né, poulain sevré et adulte  Importance des facteurs favorisants  Infection nosocomiale  Certains sérovars prédominent dans un envrnmt donné  Problématique des porteurs asymptomatiques  Emergence rapide de souches ATBrésistantes  Résistance des Salmonella dans le milieu extérieur !!  CONDITIONS D'HYGIENE

39 Salmonellose équine  Septicémie  Entérite aiguë  Entérite chronique

40 Caractéristiques  Nomenclature des Salmonelles !  Une seule espèce : Salmonella choleraesuis  7 sous-espèces dont S. choleraesuis subsp choleraesuis  Nombreux sérovars ( > 2200) : Ag O, Ag H (et Ag Vi)  Sérovars les plus fréquents chez le cheval :  S. typhimurium, S. hadar, S. anatum, S. agona, S. newport,.. ( nomenclature en raccourci !)  Coccobacilles Gram nég, mobiles, Aérobie, cat +, O/F : F  Gassner +, fermentation lactose -, Ox -  Milieux d'enrichissement (tétrathionate), 42 °C  Tests d'agglutination rapide sur lame  Galeries biochimiques de confirmation, PCR

41 Facteurs favorisants  Environnement contaminé sol ( 1 an), crottins séchés ( > 2,5 ans !), eau ( > 9 mois)  Dose infectante  Stress  ATB (dérive de flore)  Virulence de la souche  Statut immun à haut risque : Milieux hospitaliers !

42 Clinique – forme gastro-intestinale cfr cours MIGA Souvent 1 à 2 jours avant diarrhée : Abattement – anorexie – et sy associés à l'endotoxémie Hyperthermie ++++ Episodes de coliques – constipation Diarrhée : profuse, liquide, malodorante, pfs hgique Déshydratation rapide Tableau variable depuis entérite légère à mortelle Diarrhée peut durer plusieurs semaines Passage à chronicité possible

43 Lésions Ulcères gastriques (infarcti veineux – toxine) Typhlo-colite aiguë, hémorragique, pseudomembraneuse foyers nécrotiques foie – rate Infarcti niveau colon (cfr prolapsus rectal)

44 Diagnostic  Clinique : CV diarrhée aiguë ou chronique : toujours effectuer une recherche Salmonella  Bactériologique ( ante mortem )  Prélèvement précoce (Salm ++ avant diarrhée)  Prélever dans le rectum (raclage de muqueuse rectale)  Biopsie rectale possible si Mat féc négatives  Conserver au frigo – 2 à 3 jours OK  Multiplier les prélèvements !  Ne jamais conclure sur base d'un seul résultat négatif  Prévenir le labo d'une demande Salmonella Conseillé : 5 prélèvements à 1 jour d'intervalle

45 Diagnostic  Clinique  Bactériologique ( post mortem )  Caecum, colon, iléon (contenu et contenant)  Ganglions mésentériques

46 Traitement  Fluidothérapie = N°1  ATBthérapie : controversée !  AINS Si ATBthérapie décidée : TMP/S, Ampi, AG, Céph ATBrésistances fréquentes et émergence rapide (plasmides) toujours réaliser un ATBgramme cfr rapports du CERVA Pronostic

47 Prévention et contrôle  Cv infectés en zone d'isolement  Conditions d'hygiène Bottes, tabliers, matériel,...! Salmonella résistent à la dessication Nettoyer (eau chaude sous pression) aussi important que désinfecter (ammonium 4°, crésol), fumigation, Attention débris organiques dans pédiluves  Porteurs asymptomatiques (10 à 20 % des cv)  Excréteurs actifs (plusieurs semaines après guérison) conseillé : 5 cultures fécales négatives pour affirmer que le cv n'est plus excréteur actif

48 DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né- E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique - Clostridium sp 2. Poulain- Salmonella sp - Clostridium sp - Rhodococcus equi - E coli - Campylobacter - Streptococcus durans - Bacteroides fragilis 3. Adulte- Salmonella sp - Clostridiose - Colitite "X" - Potomac Horse Fever 4. Diarrhées induites par les ATB

49 4 - Rhodococcus equi chez le poulain forme gastro-intestinale de rhodococcose associée ou non à la forme pulmonaire douleur abdominale, perte de poids, diarrhée isolement de Rh equi dans M féc : pas un indice de diagnostic déterminer virulence des souches (plasmide de virulence) cfr diagnostic et ttm de la forme pulmonaire 5 - E coli (cfr septicémie) 6 - Campylobacter : rôle controversé 7 - Streptococcus durans 8 - Bacteroides fragilis

50 DIARRHEE : CAUSES BACTERIENNES 1. Nv-né- E coli, Actinob. sp, Salm : contexte septicémique - Clostridium sp 2. Poulain- Salmonella sp - Clostridium sp - Rhodococcus equi - E coli - Campylobacter - Streptococcus durans - Bacteroides fragilis 3. Adulte- Salmonella sp - Clostridiose - Colitite "X" - Potomac Horse Fever 4. Diarrhées induites par les ATB

51 9 - Potomac horse fever Neorickettsia risticii (ancien nom : Ehrlichia risticii) Fièvre équine du Potomac (Rivière dans le Maryland, USA) Identifiée en Am Nord et certains pays Am Sud, suspectéee en Europe Postulat de Koch rempli Transmission via ingestion de trématodes infectés (hypothèse) Localisation intracellulaire (monocytes, macrophages, cellules épithéliales intestinales) fièvre, anorexie, oedème des membres, fourbures très fréquentes typhlocolite et diarrhée (sévérité variable) avortements possibles taux de mortalité jusqu'à 30 % diagnostic sérologique en routine aux USA traitement : tétracyclines (!) Vaccins inactivés disponibles aux USA (efficacité discutable à cause de l'hétérogénéité des souches)

52 OPTION EQUINE II – SYSTEME DIGESTIF 1 - PATHOLOGIES BACTERIENNES 2 – APPROCHE DIAGNOSTIQUE Annick Linden Service de Bactériologie Dptmt des Maladies Infectieuses et Parasitaires

53 Lactobacillus Clostridium spp E coli Rhodococcus spp Veillonella Bacteroides spp Enterococcus spp Propionibacterium Eubacterium spp Aerococcus spp Salmonella spp Streptococcus spp Flore intestinale chez le cheval E coli Salmonella spp Clostridium perfringens Streptococcus spp et Enterococcus spp Staphylococcus spp

54 1. SAMPLING PROCEDURES : ANTE – POST MORTEM 2. BACTERIOLOGIC ANALYSIS  DIRECT SMEARS  QUALITATIVE APPROACH  QUANTITATIVE APPROACH (Clostr)

55 1. DIRECT SMEARS (SHIFT OF THE FLORA ?) Photo

56 Bacterio  2 - Approche qualitative –Aérobiose –37°C – 24H –Anaérobiose –37°C – 24H –80%N 2 – 10%CO2 – 10% H 2 –Confirmation d’identité - Columbia Agar 5% sheep blood - Gassner - Enrichissement tétrathionate - Agar au sang sans ATB - Agar au sang + polymyxine B - Agar au sang + cyclosérine - Galeries biochimiques API 20E et Rapid ID32A

57  3 - Approche quantitative – Clostridium sp Matières fécales Dilutions successives (10 -1 à ) Ensemencement Incubation (aérobiose et anaérobiose) Dénombrement des colonies cv > 10 3 CFU/ml contenu intestinal bv > 10 6 CFU Bacterio

58 Photo étuve anaérobique

59 SAMPLING PROCEDURES CLOSTRIDIUM PERFRINGENS - LIGATED INTESTINAL PORTION (20 CM) - AS SOON AS POSSIBLE TO THE LAB, ON WET ICE - FREEZING IS AN ALTERNATIVE BUT NOT IDEAL TO THE LAB WITHIN A FEW HOURS Photo

60 QUANTITATIVE APPROACH ( C. PERF) CULTURES IN ANAEROBIC CHAMBERS OR JARES COUNTS OF CFU ( BY SERIAL DILUTIONS ) Interpretations must be taken with caution IN HORSE : ABNORMAL COUNT IF > 10 3 CFU C. PERF/ ML OF INT CONTENT

61 QUALITATIVE APPROACH ( C. PERF) IDENTIFICATION OF THE BACTERIA IDENTIFICATION OF THE TOXINS INVOLVED 1. TOXIN DETECTION - FROM GUT CONTENTS OR CULTURE SUPERNATANTS - IN VIVO TESTS - ENZYME IMMUNOASSAYS (COMMERCIAL KITS) - LABILITY OF TOXINS 2. GENE DETECTION - MULTIPLEX PCR - GENOTYPE VERSUS PHENOTYPE ?

62 ENTEROTOXEMIA DIAGNOSIS IDEAL SITUATION •SUDDEN DEATH •ACUTE HEMORRHAGIC SEGMENTAL ENTERITIS •BACTERIAL QUANTITATION WITHIN A FEW HOURS •COUNTS > 10 3 CFU/ML ( HORSE ) •TOXIN DETECTION ( ELISA AND PCR) DIAGNOSTIC IN A GLOBAL APPROACH

63 Photo entérite hémorragique segmentaire

64 Photos

65 En bref et tout système confondu 1 - Lawsonia intracellularis 2 - Clostridium piliforme 3 - Taylorella equigenitalis

66 1 - Lawsonia intracellularis (pour information) Bacille Gram nég, acido-résistant, non sporulé cultivable sur cellules intestinales de rat in vivo, dans le cytoplasme apical des entérocytes responsable des entérites prolifératives du porc décrit également chez le cheval Diagnostic : - Histopathologie : coloration de Warthin-Starry - Immunofluorescence et PCR (muqueuse iléon)

67 2 - Maladie de Tyzzer – Clostridium piliforme Hépatite chez le poulain - premières semaines de vie Clostridium piliforme ( ancnmt : Bacillus piliformis) Bacille intracellulaire, sporulé, non cultivable sur milieux inertes Tableau variable : fièvre, dépression, anorexie, ictère, diarrhée,.. Souvent poulains trouvés morts sans signes prémonitoires Transmission féco-orale : ingestion de spores Hépatite nécrosante multifocale Diagnostic histopathologique : coloration de Warthin-Starry Traitement décevant (Pén, Erythromycine)

68 3 - Métrite contagieuse équine – Taylorella equigenitalis Liste B de l'OIE Infection sexuellement transmissible Etalon: porteur asymptomatique (fourreau, fosse urétrale, urètre, sperme) Jument : endométrite (formes chroniques csq fécondité) Importance économique, entrave aux échanges commerciaux Coccobacille à Gram nég, non sporulé, micro-aérophile Conditions optimales de culture ( gélose chocolat, 7 % CO2) Diagnostic – Ecouvillons pour bactéries anaérobies (AMIES charbon)!! Mesures réglementaires concernant techniques d'écouvillonnage (cfr sites précis de prélèvmt) et modalités de mise en culture. Ecouvillons transmis au labo (agréé) dans les 24 heures !

69 merci de votre attention


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