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Cours M1 - 2012 Introduction aux techniques de biologie moléculaire Partie 2.

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1 Cours M Introduction aux techniques de biologie moléculaire Partie 2

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4 Western-blot Extraction des protéines Echantillon d’origine:  Tissu (foie, cœur, etc…)  Cellules (cultures primaires, lignées cellulaires) Extraction des protéines:  Tampon - PBS/EDTA + Inhibiteurs de protéases - Tris-HCl  Séparation fraction/extraits totaux - Centrifugation - Ultracentrifugation Débris cellulaires Surnageant = Protéines

5 Western-blot Dosage des protéines - Méthode du Biuret:- Méthode de Lowry: Réduction du Cu2+ en Cu+ Réaction avec Trp, Tyr, Cys Réduction du réactif de Folin Couleur bleue, pic abs 550 nm(phénolique: jaune en bleue), pic abs 750 nm Peu sensible2-100 µg, zone de linéarité étroite - Méthode de Bradford: Bleu de Coomassie (se lie à Arg, Tyr, Trp, His, Phe) Rouge (abs 470 nm) et bleu lorsque lié aux protéines (abs 595 nm) Très sensible (0,2 – 20 µg), très rapide, interférence avec certains détergents - Méthode BCA Acide bicinchonique Formation complexe coloré avec Cu+ Couleur violette, pic abs à 562 nm Très sensible, rapide, compatible avec les détergents

6 Western-blot Dosage des protéines: exemple Solution d’Albumine bovine à 1 mg/mL Dilution en séries Mesure au spectrophotomètre Concentration DO Droite étalonnage DO échantillon Conc échantillon Echantillon à doser Distribution

7 Western-blot Dépôt et migration des échantillons Gel SDS-page Sodium Dodecyl Sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis Gel de séparation (pH 8,8) 5-15% acrylamide Gel de concentration (pH 6,8) 5% acrylamide) Sens de migration + pourcentage est élevé + densité réseau est élevée + mailles sont serrées

8 Dépôt et migration des échantillons Solution de dépôt: - Tampon HCl pH 6,8  Idem gel de concentration - Bleu de bromophénol  Suivi de la migration - Glycérol  Densifier l’échantillon Western-blot Séparation selon le poids moléculaire des protéines

9 Western-blot Coloration du gel  Contrôle de l’homogénéité de la migration  Vérification de la présence de protéines  Bleu de Coomassie (coloration homogène)  Nitrate d’Argent (plus sensible, parfois moins homogène)

10 Western-blot Transfert sur membrane - Pression, application d’un courant - Fixation des protéines de façon non-spécifique: - Interactions ioniques - Interaction hydrophobes - Membranes nitrocellulose / PVDF

11 Western-blot Coloration de la membrane  Contrôle de l’efficacité du transfert  Contrôle de l’homogénéité des dépôts  Coloration réversible

12 Les fluorochromes Immunocytochimie  Substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation  Sont caractérisés par: - un spectre d’absorption - un spectre d’émission Ex: Fluorescéine Absorption des radiations bleues (max 490 nm) Émission d’une fluorescence verte (max 520 nm)

13 Les fluorochromes Diagramme de Jablonski Immunocytochimie S0 État fondamental S1 État excité Niveau d’énergie des électrons d’une molécule fluorescente Laser Absorption Fluorescence Emission

14 Étude des facteurs de transcription Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Gel retard Facteur de transcription activé Recrutement du complexe d’activation de la transcription ADN Séquence de fixation spécifique GèneTATA box  Étude de la fixation d’un facteur de transcription sur sa séquence cible

15 Principe (1) Gel retard  Retard de migration dans un gel natif de polyacrylamide de duplexes d'oligonucléotides de séquences courtes (15 à 30 nucléotides) en présence de protéines (ou de complexes protéiques) ayant la propriété de reconnaître spécifiquement la séquence d'intérêt.  Marquage radioactif au P 32 des sondes nucléotidiques.  Spécificité de reconnaissance des sondes marquées testée par l'ajout en excès du même duplexe non radioactif qui entrent en compétition avec la forme radioactive.  Présence de protéines spécifiques dans le complexe retardé peut être mise en évidence par l'ajout d'anticorps spécifiques qui permettent un retard plus important sur le gel appelé " supershift ".

16 * * Sonde libre Principe (2) Gel retard * * * * * * Sondes spécifiques marquées au P 32 + Protéines nucléaires extraites - Fixation de la protéine sur sa séquence cible - Élimination des autres Dépôt sur un gel natif * * * * * * * * Sonde + protéine * * Sonde + protéine + Ac = « Super-Shift »

17 Résultats Gel retard Extraits nucléaires de cellules Hela Inconvénients: - Extraction de protéines nucléaires - Manipulation de la radioactivité

18 Le microscope à fluorescence Immunocytochimie  Filtre correspondant au fluorochrome utilisé  Filtre d’excitation (2): permet de sélectionner les radiations absorbées par le fluorochrome (fluorescéine: 490 nm)  Miroir dichroïque (3): ne réfléchit que les radiations absorbables vers l’échantillon et ne laisse passer par transmission que les radiations vertes (fluorescéine: > 500 nm)  Filtre d’émission (6): ne laisse passer par transmission que les radiations vertes (fluorescéine: > 500 nm) 1-lampe à arc 2-filtre d'excitation 3-miroir dichroïque 4-objectif 5-préparation 6-filtre d'émission 7-oculaire

19 Le microscope à fluorescence Ex: Fluorescéine Immunocytochimie Le filtre d'excitation sélectionne les radiations spécifiques du fluorochrome......qui sont réfléchies par le miroir et éclairent l'échantillon......celui-ci émet les radiations de fluorescence qui seules atteignent l'oculaire.

20 small interfering RNA (siRNA) siRNA  ARN simple ou double brin, qui interfère avec un ARNm spécifique conduisant à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en protéine  Mécanisme très spécifique  Permet l’étude des gènes

21 RNA interférence siRNA ARN double brin introduit dans la cellule (siRNA) DICER Complexe RISC (RNA-Induced Silencer Complex) Elimination d’un des brins du siSNA, dit « passager » Ciblage des ARNm de la cellule possédant une séquence complémentaire DICER Ribonucléase qui clive l’ARN double brin toutes les 21 à 25 pb Clivage de l’ARNm cible par RISC

22 - Nécessité d’une complémentarité parfaite entre le siRNA et sa cible  Mécanisme très spécifique - Possibilité de choisir un siRNA capable de cibler un ARNm porteur d’une mutation ponctuelle sans affecter l’ARNm sauvage RNA interférence siRNA - Introduction du siRNA 24h avant le début de la manip - Vérification par western-blot de l’extinction de la protéine Frede et al., 2005Anand et al., 2007

23 Extraction d’ARN  Molécules très fragiles - Matériels stérile, RNAses et DNAses free - Travail sur glace - Port de gants - Pointes avec filtre  Extraction Phénol/Chloroforme  Utilisation du Trizol ® : - Phénol = isole les ADN et ARN - Isothiocyanate de guanidium = dénaturation protéines - Anti-RNases Extraction d’ARN


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