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Méthodes détude des virus et de diagnostic virologique Chapitre 9 du cours de Virologie Générale MATIERE DEXAMEN.

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1 Méthodes détude des virus et de diagnostic virologique Chapitre 9 du cours de Virologie Générale MATIERE DEXAMEN

2 Vous disposez de deux heures pour : o Evoluer dans ce diaporama relatif au chapitre 9 du cours de virologie générale o Visionner les films relatifs à plusieurs méthodes définis par lassistante Les questions pourront être posées lors des jours suivants de TP Objectifs

3 Intérêt en virologie : production de virus en laboratoire différents types Les différents types de cultures cellulaires o Culture de cellules primaires : cellules mises en culture à partir de lorgane prélevé chez lanimal (souvent un fœtus), utilisées dès la 1ère culture. o Lignée diploïde : nombre de chromosomes constant, durée de vie limitée (cellules meurent après un certain nombre de divisions) o Lignée continue : transformées in vitro ou provenant de tumeurs, aneuploïdes, durée de vie illimitée Milieu de culture Milieu de culture : liquide, riche en acides aminés, minéraux, tampon pH, source dénergie, facteurs de croissance, facteurs dattachement. 9.1 La culture de cellules

4 La culture de cellules Cellules adhérentes : Cellules adhérentes : 2 types de morphologies : épithéliale (polygonale) et fibroblastique (étiré). Cellules non adhérentes : Cellules non adhérentes : Flottent dans le milieu de culture Sphériques Destinées à la production cellulaire en masse.

5 Les cellules

6 Les supports

7 Supports de cultures cellulaires

8 Plaque de 6 puits Plaque de 96 puits

9 La notion du passage cellulaire

10 9.2 Dénombrement des particules virales Définitions : o Particules physiques = infectieuses + non infectieuses o Particules infectieuses = particules dénombrées par la méthode des plages de lyse ou de la méthode des DICC 50 Méthode des plages de lyse Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules Dénombrement de particules physiques

11 Effet cytopathogène

12 Méthode des plages de lyse-Particules infectieuses ND T- Concentration virale de départ (non diluée) ? 200 µl / puits

13 ND T Méthode des plages de lyse-Particules infectieuses Moyenne de 6,25 Plages de lyse à la dilution La concentration virale de départ est de 3, UFP / ml.

14 Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules (DICC 50 ) On cherche la dilution virale pour laquelle 50% des supports de cellulles montrent un effet cytopathogène (cette dilution est celle dont le volume contient une DICC 50 ).

15 Détermination de la dose infectieuse en culture de cellules T DICC µl par puits

16 Dilution virale Nbre dinfectés/ Nbre dinoculés Nbre Nbre dinfectés de non infectés Nbre Nbre dinfectés de non infectés Somme Somme I non I I non I % dinfectés / / / / / / / / Le point dinfectivité à 50 % se situe entre et : (64-50) / (64-7) = 0.25 Cela signifie que 50 µl dune dilution à 10 -5,25 contient 1 DICC 50, donc, le titre de la suspension virale 1/10 -5,25 X 1000/50 = 3, DICC 50 / ml

17 Dénombrement des particules physiques - Microscopie électronique Particules physiques : microscopie électronique Particules physiques enveloppées Particules physiques non enveloppées

18 Récapitulatif Récapitulatif : 9.2 Dénombrement des particules virales Particules infectieuses : 2 méthodes - Plages de lyse - DICC 50 Particules physiques : Microscopie électronique

19 9.3 Purification des virus Par centrifugation : Par centrifugation : –1.Centrifugations différentielles : »Centrifugation à basse accélération »Centrifugation à haute accélération sur surnageant Obtention dun culot contenant le virus semi-purifié –2.Ultracentrifugation : séparation virus-impuretés par propriétés physiques »"en gradient de densité à léquilibre" (séparation sur base de la densité) »"zonale" (séparation sur base de la vitesse de sédimentation) Obtention dune suspension de virus très purifiée

20 9.4 Etude de lacide nucléique viral Analyse de restriction et hybridation moléculaire Analyse de restriction et hybridation moléculaire Amplification génique (PCR) Amplification génique (PCR) –Conventionnelle –PCR en temps réel Séquençage Séquençage

21 La PCR en temps réel

22 Chimie des intercalants Chimie des intercalants : Chimie des intercalants : Molécules (SYBR Green, bromure déthidium) ayant la propriété de sintercaler de façon aspécifique dans les doubles brins dADN, conformation qui les rend fluorescentes. Excitation (UV) émission de fluorescence lecture

23 PCR en temps réel Chimie des sondes : Chimie des sondes : Fixation dune sonde spécifique du fragment amplifié, lié à 2 fluorochromes, 1 émetteur (en vert) et 1 récepteur (en rouge). Sonde intègre : émission uniquement par fluo récepteur (rouge) Polymérisation action exonucléasique de la polymérase sonde lysée séparation fluo émetteur et fluo récepteur Emission par fluo émetteur (vert) Chimie des sondes Ex. : TaqMan

24 Séquençage de lADN Détermination précise de la séquence en nucléotides (laboratoires spécialisés) Détermination précise de la séquence en nucléotides (laboratoires spécialisés) Méthode de Sanger (plus rarement Maxam et Gilbert) Méthode de Sanger (plus rarement Maxam et Gilbert) Si virus à ARN : ADN complémentaire nécessaire Si virus à ARN : ADN complémentaire nécessaire A partir du produit de PCR ou clonage de la séquence A partir du produit de PCR ou clonage de la séquence Application : Lors dépidémie (ex. : intoxication alimentaire), isolement dun virus, puis envoi au labo qui séquence une partie déterminée du génome de la souche pour permettre un typage très fin du virus.

25 9.5 Etude des protéines virales Marquage radioactif : un acide aminé essentiel du milieu remplacé par le même ayant incorporé un isotope radioactif (méthionine marquée S 35 ). Marquage de toutes les protéines néosynthétisées. Marquage radioactif : un acide aminé essentiel du milieu remplacé par le même ayant incorporé un isotope radioactif (méthionine marquée S 35 ). Marquage de toutes les protéines néosynthétisées. Electrophorèse en gel de polyacrylamide : séparation des protéines selon leur masse moléculaire, révélation par radioactivité ou colorants spécifiques des protéines. Electrophorèse en gel de polyacrylamide : séparation des protéines selon leur masse moléculaire, révélation par radioactivité ou colorants spécifiques des protéines. Western blotting ou Immunoblot : électrophorèse, transfert sur membrane puis identification des déterminants antigéniques par des anticorps spécifiques et révélation par une méthode immuno-enzymatique. Western blotting ou Immunoblot : électrophorèse, transfert sur membrane puis identification des déterminants antigéniques par des anticorps spécifiques et révélation par une méthode immuno-enzymatique.

26 Immunoprécipitation Extraction dune protéine dun mélange de protéines marquées radioactives, par des anticorps spécifiques liés à des billes de sépharose, Centrifugation, Analyse par électrophorèse. Marquage radioactifImmunoprécipitation Electrophorèse

27 Récapitulatif Récapitulatif : METHODES DETUDE 9.4 De lacide nucléique viral9.5 Des protéines Analyse de restriction Marquage radioactif Southern blot Immunoprécipitation PCR Electrophorèse Séquençage Western blot

28 9.6 Diagnostic des infections virales Pathologie clinique observée, récolte des signes cliniques Diagnostic différentiel Confirmation de létiologie par : - Mise en évidence de lagent pathogène (direct) - Mise en évidence de la réponse immunitaire (indirect)

29

30 Diagnostic des infections virales B. Méthodes de diagnostic indirect (mise en évidence de la réponse immune, Ac) o Elisa indirect o Immunofluorescence indirecte o Séroneutralisation o Inhibition de lhémagglutination A.1 Non spécifiques Détermination de lorigine virale, sans identification de lagent étiologique o Effet cytopathogène o Test dhémadsorption A. Méthodes de diagnostic direct (mise en évidence du virus, Ag) A.2 Spécifiques Mise en évidence directe dun constituant du virus o Détection du génome o Détection des protéines

31 A.1 Méthodes de diagnostic direct non spécifique I. Effet cytopathogène en culture de cellules

32 Méthodes de diagnostic direct non spécifique II. Test dhémadsorption : Virus des oreillons virus Sendai (paramyxovirus)

33 A.2 Méthodes de diagnostic direct spécifique Enveloppe Tégument DNA Capside Glycoprotéines

34 Méthodes de diagnostic direct spécifique I. Visant la détection de lADN viral à partir du prélèvement II. Visant la détection des protéines virales : Techniques immunoenzymatiques (ELISA) Techniques immunofluorescence

35 ELISA direct Réactifs - Ac spécifiques des Ag dintérêt - Echantillon inconnu Laisser incuber (temps de réaction) Lavages (enlève toutes substances non liées) - Ac couplés à une enzyme (E) spécifique des Ag dintérêt Laisser incuber (temps de réaction) Lavages (enlève tous les Ac-E non liés) - Substrat de lE POSITIF : substrat converti en produit coloré NEGATIF : pas de coloration Echantillon positif Echantillon négatif Ag présents et fixation aux Ac Ag absent Etape 1 : Ajout de léchantillon sur le support Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de lenzyme Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme

36 Immunofluorescence (direct spécifique)

37 Ac anti-gC disotype IgG2a Ac anti-gE disotype IgG1 Goat anti-IgG2a de souris couplé à la FITC Goat anti-IgG1 de souris couplé à la R-PE ** gE gC Immunofluorescence

38 FITC emission anti-gC R-PE emission anti-gE Merge Sample 1 Sample 2 Immunofluorescence

39 B. Méthodes de diagnostic indirect o ELISA indirect o Immunofluorescence indirecte o Séroneutralisation o Inhibition de lhémagglutination

40 ELISA indirect Réactifs - Ag - Echantillon inconnu Laisser incuber (temps de réaction) Lavages (enlève toutes substances non liées) - Ac couplés à une enzyme (E) spécifiques des Ac (antiglobuline) Laisser incuber (temps de réaction) Lavages (enlève tous les Ac-E non liés) - Substrat de lE POSITIF : substrat converti en produit coloré NEGATIF : pas de coloration Echantillon positifEchantillon négatif Ac spécifiques présents et se fixent aux Ag Ac spécifique absent ; les autres Ac sont éliminés aux lavages Etape 1 : Ajout de léchantillon sur le support Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de lenzyme Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme

41 ELISA indirect de blocage Réactifs - Ag - Echantillon inconnu Laisser incuber (temps de réaction) Lavages (enlève toutes substances non liées) - Ac couplés à une enzyme (E) spécifiques des Ag Laisser incuber (temps de réaction) Lavages (enlève tous les Ac-E non liés) - Substrat de lE POSITIF : pas de coloration NEGATIF : substrat converti en produit coloré Echantillon positifEchantillon négatif Ag viraux fixés ; les Ac spécifiques sy fixent Ac spécifique absent ; les autres Ac sont éliminés aux lavages Etape 1 : Ajout de léchantillon sur le support Etape 3 : Révalation par ajout du substrat de lenzyme Etape 2 : Ajout des anticorps couplés à une enzyme

42 Séroneutralisation Basée sur la capacité des Ac à empêcher le virus dinfecter un tapis cellulaire. Réactifs - virus - Echantillon inconnu Laisser le temps à la réaction Ag-Ac de se produire Ajouter le mélange sérum-Ag à la culture de cellules Laisser incuber (temps de multiplication du virus) POSITIF : les Ac ont empêché la multiplication virale : le tapis cellulaire est intact NEGATIF : le virus sest multiplié et a détruit le tapis cellulaire Echantillon positif Echantillon négatif Ac spécifiques se fixent aux virus Ac spécifique absent Etape 1 : Mélange du sérum à tester avec une suspension virale Etape 3 : Lecture du résultat après coloration Etape 2 : Mise en contact du mélange avec un tapis cellulaire confluent

43 Séroneutralisation T - Sérum 1Sérum 2Sérum 3Sérum 4 1/2 1/4 1/8 1/32 1/16 1/64 T +

44 Inhibition de lhémagglutination Basé sur la capacité des Ac à neutraliser le virus Pas de fixation du virus aux GR Réactifs - Virus - Echantillon inconnu Laisser le temps à la réaction Ag-Ac de se produire Ajouter une suspension de globules rouges (GR) POSITIF : les Ac ont empêché la fixation des GR aux virus inhibition de lhémagglutination NEGATIF : le virus se fixe aux GR hémagglutination Echantillon positif Ac spécifiques se fixent aux virus Echantillon négatif Ac spécifique absent Inhibition de la fixation des virus aux GR Fixation des virus aux GR Etape 1 : Mélange du sérum à tester avec une suspension virale Etape 3 : Lecture du résultat (voir photo dia suivante) Etape 2 : M élange avec une suspension de globules rouges

45 Récapitulatif Récapitulatif : 9.6 METHODES DE DIAGNOSTIC B. Méthodes de diagnostic indirect (mise en évidence de la réponse immune, Ac) o Elisa indirect o Immunofluorescence indirecte o Séroneutralisation o Inhibition de lhémagglutination A.1 Non spécifiques Détermination de l origine virale, sans identification de lagent étiologique o Effet cytopathogène o Test dhémadsorption A. Méthodes de diagnostic direct (mise en évidence des virus, Ag) A.2 Spécifiques Mise en évidence directe dun constituant du virus o Détection du génome o Détection des protéines


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