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Elisabeth Huguet Institut de Recherche sur la Biologie de l’Insecte Cours M2 Recherche Infectiologie cellulaire et moléculaire, Vaccinologie UES3-1 Santé.

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1 Elisabeth Huguet Institut de Recherche sur la Biologie de l’Insecte Cours M2 Recherche Infectiologie cellulaire et moléculaire, Vaccinologie UES3-1 Santé Publique Septembre 2008 Université F. Rabelais, Tours UMR CNRS 6035 France La double vie d’un virus fascinant impliqué dans des interactions hôtes-parasites chez les insectes

2 Cotesia congregata parasite la chenille Manduca sexta

3 Cotesia congregata (Guêpe Braconidae) Conséquences du parasitisme X X X X Arrêt du développement Immunosuppression XX Manduca sexta

4 Cotesia congregata (Guêpe Braconidae) Implication d’un troisième partenaire ? X X X X Arrêt du développement Immunosuppression Manduca sexta Cotesia congregata bracovirus

5 Oeufs de guêpe + Virus (Beckage et al,1994) (Edson et al, 1981) Le virus est indispensable à la réussite parasitaire Oeufs de guêpe lavés (sans virus) Oeufs de guêpe + Virus + psoralène Blocage expression virus

6 Le virus existe sous deux formes … 1. Une forme virale « libre » constituée de multiples cercles d’ADN double brin Virus DNA MW FIGE 2.5 kb 7.5 kb 5 kb 10 kb 25 kb 20 kb 15 kb 40 kb 35 kb 30 kb 45 kb Cette forme est présente en large excès dans les ovaires des femelles guêpes

7 Le virus existe sous deux formes … Sonde ADN viral « EP1 » Signal non attendu ! 5 kb Sonde ADN viral « EP1 » Taille attendue 5 kb ADN guêpe

8 Le virus existe sous deux formes … 1. Une forme virale linéaire intégrée au génome de la guêpe PV4 PV10 EP  Belle et al., 2002 Expériences d’hybridations in situ sur chromosomes de guêpes

9 Le virus existe sous deux formes … Transmission verticale à la descendance Réplication Peu d’expression des gènes viraux Pas d’intégration dans le génome PAS de réplication Expression forte des gènes viraux Dans la guêpe : Dans la chenille :

10 Réplication virale 5 Expression des gènes viraux Production de protéines virales Oviposition Injection de virus Dérégulation de la physiologie de l’hôte Succès parasitaire de la guêpe Cotesia congregata bracovirus est indispensable à la réussite parasitaire de la guêpe

11 Cellules ovariennes de C. congregata Production des cercles viraux Manduca sexta Injection des particules virales Succès du parasitisme Expression des gènes viraux Alteration du developpement Alteration de l’immunité Protéines de capsides Formation virales Génome intégré (chromosome 5) REPLICATION & MORPHOGENESE VIRALES EXPRESSION DES GENES DE VIRULENCE Cycle du bracovirus de Cotesia congregata

12 Symbioses : mutualisme/parasitisme Virus qui joue un rôle central Association mutualiste Avec une guêpe Association parasitaire Avec une chenille Sans le virus la guêpe ne peut pas assurer sa descendance Sans la guêpe le virus ne peut pas se répliquer et se transmettre : virus ayant perdu son autonomie

13 Associations virus-guêpes BracovirusIchnovirus > espèces de guêpes Braconidae > espèces de guêpes Ichneumonidae

14 Ichneumonoidae Ichneumonidae Braconidae 35 sous familles qui ne possèdent pas de PDV 34 sous familles qui ne possèdent pas de PDV Campopleginae Banchinae espèces Ichnovirus Complexe Microgastroïde (7 sous familles) espèces Bracovirus Origine indépendante de l’association virus-guêpe chez les guêpes Braconidae et Ichneumonidae Deux familles de virus associées à deux familles de guêpes

15 Origine des associations guêpes braconidae-virus >17000 espèces Meteorinae Macrocentrinae Aphidiinae Opiinae Alysiinae Doryctinae Braconinae BRACONIDAE MICROGASTRINAE Miracinae Cheloninae Cardiochilinae MICROGASTRINAE-Cotesia Miracinae Cheloninae Cardiochilinae Virus ancêtre Guêpe ancêtre (70 millions d’années)

16 Les questions scientifiques Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Quel est la nature du virus ancêtre ? BRACONIDAE Virus ancêtre

17 Les stratégies utilisées Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Quel est la nature du virus ancêtre ? Séquençage du génome viral libre Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées

18 Génome de C. congregata Bracovirus (CcBV) 30 cercles d’ADN db 567 kb 27 % de régions codantes 156 gènes potentiels Organisation en familles multigéniques Séquençage de la forme libre du virus Espagne et al. Science 2004

19 Contenu du génome de CcBV

20 Contenu du génome de CcBV Nature du virus ancêtre ? Très peu de gènes « viraux » 1 gène de baculovirus 1 gène d’ascovirus gènes de rétroéléments DIRS et Dong gènes de polintons Ne renseignent pas sur la nature du virus ancêtre

21 Contenu du génome de CcBV Nature du virus ancêtre ? Familles multigéniques à motifs conservés: Protéines-Tyrosine-Phosphatases Inhibiteurs NFKB : IKB Cystatines Protéines riches en cystéines Potentiellement de nombreux facteurs de virulence impliqués dans dérégulation de la physiologie de la chenille

22 Analyse des gènes exprimés par reverse northern. ADN viral Digestion enzymatique Sonde P 32 d’ADNc chenilles parasitées Sonde P 32 d’ADNc chenilles non parasitées Protéines Tyrosines Phosphatases Inhibiteurs NFKB Cystatines Découpage Clonage séquençage

23 Gènes de la famille des IκB Gènes codant pour protéines IκB interviennent dans la régulation de la réponse immunitaire innée chez les mammifères et les insectes (voies Toll) Interaction avec le facteur de transcription NF- κB Motif présent dans toutes les protéines IκB : domaine de répétitions ankyrines Gènes IκB-like chez les bracovirus et ichnovirus 9 gènes IkB chez CcBV

24 Voie Toll chez la Drosophile Toll Tube Pelle NFkB (Dorsal) IkB (Cactus) Activation de peptides antimicrobiens Bacteries Gram+ Champignons noyau

25 Modèle du mode d’action des IkB viraux sur l’immunité chez Manduca Toll-like NFkB IkB Activation de la réponse antiparasitaires Reconnaissance guêpe parasite noyau

26 Modèle du mode d’action des IkB viraux sur l’immunité chez Manduca Toll-like NFkB IkB Reconnaissance guêpe parasite noyau Injection de CcBV IkB viraux X Pas d’activation de gènes de l’immunité

27 Contenu du génome de CcBV Nature du virus ancêtre ? Familles multigéniques à motifs conservés: Protéines-Tyrosine-Phosphatases Inhibiteurs NFKB : IKB Cystatines Protéines riches en cystéines

28 Implication des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ? Cercle 19 3 Cystatines

29 Cystatines ? Cystatines = inhibiteur de protéases à cystéine Cystatines de type 2 Première description de cystatines virales Chez les nématodes parasites les cystatines sont des facteurs de virulence G QxVxG PW Cibles des cystatines : protéases à cystéine de la famille C1 Ex : papaine et cathepsine

30 Protéases à cystéine (type C1) des insectes : Digestion Développement (métamorphose et mue) Immunité ? Cystéine protéases ciblées chez les insectes ? 26/29 kDa C1 cysteine protease CathepsinB Cathepsin L Libération De protéase Surexpression (ARNm) Surexpression (ARNm) SarcophagaMouche tsetseDrosophile

31 Quel est le rôle des cystatines virales dans l ’ interaction hôte-parasite ? Evolution moléculaire des cystatines virales Est-ce que les cystatines virales sont exprimées ? Les cystatines virales sont-elles des protéines inhibitrices fonctionnelles ? Quelles sont les cibles des cystatines virales chez Manduca ?

32 Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite ARNm cystatines ARNm actine Analyse par Northern Corps grasHémocytes

33 Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite Analyse par Western Hemolymphe P NP 16,5 32,5 25 KDa Cystatines (13 kDa) Anticorps Anti-Cystatine1

34 Expression et purification d’une protéine recombinante Cystatine 1 Fractions élution Expression de CcBV cystatine1 dans des cellules d’insectes Hi5 Purification sur colonne de papaïne Cystatine 1

35 CcBV Cystatine 1 recombinante est un inhibiteur de protéases à cystéine actif Papain Relative Activity (%) Cystatine 1 (nM) Relative Activity (%) Cathepsin B Cathepsin L S. peregrina 29 kDa cysteine protease Espagne et al. Journal of Virology 2005

36 Modèle de travail _ Perspectives Parasitisme Œufs de guêpe + bracovirus Production de protéases à Cystéine Nouvelle composante de la réponse immunitaire des insectes ? Inhibition par les cystatines de CcBV ?

37 Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Quel est la nature du virus ancêtre ? Séquençage du génome viral libre Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées Les questions scientifiques ?

38 Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes Nature du virus ancêtre ? Pas de réplication dans la chenille hôte Les gènes viraux n’ont pas besoin d’être cod é s par les cercles Les g è nes viraux sont exprim é s massivement dans les ovaires Les g è nes viraux sont dans le g é nome de la guêpe ? Chromosome 5 guêpe

39 Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes 1. Recherches de protéines virales (capside, polymérase, enveloppes) Par une approche transcriptomique et protéomique sur les ovaires -banque EST d’ovaires de guêpes -analyse des protéines à partir de virus purifiés des ovaires Nature du virus ancêtre ? Nouvelle strat é gie 2. Analyse de la forme intégrée du virus

40 Analyse du transcriptome d’ovaires répliquant le virus: 6000 EST d’ovaires de Cotesia congregata Comparaison dans les banques de données Identification des protéines de structure des virions: Séquençage des protéines constitutives des particules purifiées Comparaison dans les banques de données et les banques d’EST 44 gènes viraux potentiels (origine virus d’insecte) Gènes impliqués dans la transcription La constitution des nucléocapsides La constitution des enveloppes des particules Gènes viraux sont intégrés au génome de la guêpe

41 Le génome du virus reflète les contraintes évolutives différentes : mutualisme/parasitisme 1. Intégration du virus ancêtre 3. « Acquisition de gènes de virulence» Transfert du génome de la guêpe vers le virus 2. « Perte de gènes viraux » Transfert vers le génome de la guêpe

42 Encore beaucoup de questions Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Mécanismes ? Quel est la nature du virus ancêtre ? Comment s’effectue la réplication ? Virus comme vecteur de transfert de gènes ? Capture des gènes et évolution ?


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