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CONTEXTE Groupe CIDPHARMEF 2008/09 CONAKRY : Pr Aliou BALDE ANGERS : Pr Olivier DUVAL.

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1 CONTEXTE Groupe CIDPHARMEF 2008/09 CONAKRY : Pr Aliou BALDE ANGERS : Pr Olivier DUVAL

2 « Thématiques structurées et spécialités scientifiques » BUT Identifier les molécules et extraits dorigine végétale possédant des propriétés anti-oxydantes et anti-AGEs et valider leurs effets thérapeutiques sur certaines maladies groupe « PROVASC »: Développement de molécules anti-oxydantes et/ou anti-AGEs dorigine naturelle pour la protection vasculaire. coordonné par Pierre Pacaud (UMR 915, Inserm / Université de Nantes)

3 Moyens 8 laboratoires sur la région Pays de Loire > 2 M sur 4 ans laboratoires * Biologie Neurovasculaire Intégrée (BNVI) Dir. D. Henrion * Substances dOrigine Naturelle et Analogues Structuraux (SONAS) Dir. P. Richomme « Thématiques structurées et spécialités scientifiques »

4 RESULTATS PRELIMINAIRES

5 Extraits hydroalcooliques de 4 plantes Guinéennes

6 Laboratoire de Biologie Neurovasculaire Intégrée (BNVI) UMR CNRS 6214 / INSERM 771 Dir. D. Henrion Membre du groupe « PROVASC »: Développement de molécules anti-oxydantes et/ou anti-AGEs dorigine naturelle pour la protection vasculaire. Test de la fonction vasculaire sur artères isolées

7 Mulvany, M.J., Halpern, W., Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation 41, Myographe pour Artères de résistance

8 1- Protocole de tests de leffet vasodilatateur des substances végétales : Exemples des deux substances contrôles : Tempol (SOD-mimétique) et apocynine (inhibiteur des NAD(P)H-oxydases). Tempol M Apocynin M W W W W W W W W W W U46619 W W B A Wall force (mN) W W U46619

9 Protocole de tests de leffet vasodilatateur des substances végétales : Les substances testées (50 µg/ml) diminuent laction vasoconstrictrice du U Une partie de cette effet résulte de la stimulation de lendothélium. SONAS 177 = Haf SONAS 178 = Haf 3 SONAS 179 = Haf 5 SONAS 180 = Per SONAS 181 = U. t. SONAS 182 = S. bowal % inhibition de la contraction Sans endothélium Avec endothélium

10 Protocole de tests de leffet vasodilatateur des substances végétales: Les 6 substances testées (50 µg/ml) induisent une vasorelaxation, en partie via la stimulation de lendothélium. SONAS 177 = Haf SONAS 178 = Haf 3 SONAS 179 = Haf 5 SONAS 180 = Per SONAS 181 = U. t. SONAS 182 = S. bowal % relaxation Sans endothéliumAvec endothélium

11 Conclusion: Vasorelaxation en partie par un effet direct sur lappareil contractile et en partie par stimulation de lendothélium vasculaire. Perspectives: 1- Eclaircir le mécanisme dinteraction avec avec lappareil contractile (effet anti-oxydant et/ou autre (s) mécanisme(s)) 2- Eclaircir le mécanisme de stimulation de lendothélium et la voie impliquée (NO, EDHF, prostanoïdes…).

12 Extractions et analyses chromatographiques : GC, CC, MPLC, CLHP- DAD & CLHP-DDL, FCPC (collaboration Kromaton Technologies) Analyses structurales : RMN 270, 300 & 500 MHz, Spectromètres de masse : Haute résolution (B/E), LC-MS n & maldi-tof SONAS : UPRES EA 921 SONAS : UPRES EA 921, Dir. Pr P. Richomme

13 VEGEPOLYS LE CONTRAT DE PÔLE : UN LABEL ET UN ENGAGEMENT 5 axes thématiques validés par le et la Recherche Innovation Variétale Qualité Sanitaire des Semences et Plants Santé et Végétal Horticulture et Paysage Urbain Veille et lIntelligence Economique

14 VEGEPOLYS : VEGEPOLYS : Les Centres Techniques Veille et intelligence économique dans le végétal CIET Centre dIntelligence Economique Territorial Horticulture et Paysage urbain Plante et Cité Innovation Variétale Qualité sanitaire des semences et des plants Santé et Végétal Centre dInnovation et de Transfert de Technologie du Végétal Spécialisé Valtech

15 Potentiel antioxydant de lorganisme Radicaux libres et ROS endogènes (respiration, système immunitaire…) ou exogènes (UV, radiations ionisantes, métaux…) Stress Oxydatif Balance oxydative Enzymatique (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase…) ou non (acide ascorbique, vitamine E, flavonoïdes, Polyphénols…)

16 Radicaux libres et ROS Tests dactivités Antioxydantes Tests AntiOxydant - AO Tests AntiOxydant - AO

17 Principe : Sous l'action des radicaux libres introduits volontairement dans un milieu réactionnel, un substrat particulier* ainsi détruit perd sa capacité de fluorescence tandis que cette dernière persiste lorsquun (des) capteur(s) de radicaux libres est(sont) incorporé(s) dans le milieu. Objectifs : Evaluation de lAO dun extrait, dun composé, dun mélange… exprimée en équivalent Trolox** par g, par mL (TE/g, TE/mL) … * -phycoerythrine, fluoresceine. (*acide hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylique, analogue synthétique hydrosoluble de la vitamin E) Tests AO – ORAC Tests AO – ORAC (Total Oxygen Radical Absorbance Capacity)

18 Tests AO - ORAC Oxydation de la fluorescéine en présence dAAPH (Ou et al, 2001)

19 => valeur ORAC exprimée en équivalents TROLOX Tests AO - ORAC

20 Test DPPH Principe : Une solution méthanolique dun radical stable, le DiPhénylPicrylHydrazyl présente une coloration violette ( max 517 nm) qui disparaît avec la destruction du radical. Objectif : Evaluation de lAO dun extrait, dun composé, dun mélange… exprimée en équivalent Trolox ou comparée à celle de conservateurs utilisés dans lindustrie agro- alimentaire : BHA (butylhydroxyanisole), BHT (butylhydroxytoluène)… Tests AO - DPPH

21 Garcinia viellardii (Clusiaceae): A.-E. HAY, M.-C. AUMOND, S. MALLET, V. DUMONTET, M. LITAUDON, D. RONDEAU and P. RICHOMME : "Antioxidant xanthones from Garcinia viellardii", J. Nat. Prod., 67 (4), (2004) Tests AO - DPPH

22 Test de Peroxydation des Lipides Principe:A partir dun modèle « naturel » (microsomes hépatiques), dosage des peroxydes en présence ou non dun(d) agent(s) AO => dosage colorimétrique (532 nm) des TBARS/MDA après oxydation (Fe 2+ /Vc ou AAPH) Objectif : Evaluation du degré de protection des acides gras polyinsaturés vis à vis de la peroxydation. Tests AO - Peroxydation lipidique

23 Principe : Génération photochimique de radicaux libres détectés par chemiluminescence. Objectif : évaluation automatisée du potentiel antioxydant de composés/mélanges hydro ou lipophiles. Mesure de lactivité de la superoxyde dismutase Inconvénient : Technique manuelle (10/j) Tests AO - Photochem®

24 RESULTATS PRELIMINAIRES

25 Tests DPPH

26 Tests Anti-AGEs = D. SERAPHIN, S. DERBRE Advanced Glycated Endproducts, inhibitors and breakers Formation des AGEs ou réaction non-enzymatique de Maillard Formation des AGEs ou réaction non-enzymatique de Maillard - Complications des diabètes - Maladies neurologiques (Alzheimer…) - Maladies articulaires… - Vieillissement tissulaire Médicaments potentiels Médicaments potentiels Actifs de produits cosmétiques ou de compléments alimentaires Actifs de produits cosmétiques ou de compléments alimentaires

27 Obtention de la quantité maximale dAGEs en un minimum de temps Obtention de la quantité maximale dAGEs en un minimum de temps - Plaque 96 puits ; détection : fluorescence λ exc 370 nm ; λ em 440 nm - Nature et concentration de la protéine : BSA 10 mg/mL - Sucre réducteur : ribose 0,5 M - Conditions physiologiques : 37 °C / tampon phosphate 50 mM pH 7,4 - Durée de lincubation : 24 h 1. J. A. Vinson et al., J. Nutr. Biochem. 1996, 7, Tests Anti-AGEs

28 Méthode de criblage des anti-AGEs Criblage de molécules pures Criblage de molécules pures - Molécule testée : gamme de concentration à M - Soustraction de la fluorescence intrinsèque de la molécule détermination de la CI 50

29 Criblage de molécules pures Criblage de molécules pures test efficace Test Anti-AGEs

30 CI 50 CI 50 Test Anti-AGEs : application au SONAS 12 => analyse complémentaire 16 inhibiteurs 52 inactifs 2 inducteurs 82 éch./SONAS

31 Criblage dextraits végétaux Criblage dextraits végétaux Derris ferruginea Tiges Feuilles Callophyllum wallichianum Ecorces de tiges Problèmes de quenching Test Anti-AGEs

32 RESULTATS PERPECTIVES

33 RESULTATS Résultats encourageants pour les AOs + sur vaisseaux En attente de mise au point pour la méthode AGEs PERPECTIVES Mise en place du projet (conventions avec Angers et autres) Convention entre pays membre Identification de la plante Échanges de chercheurs …

34

35 Protocole de tests de leffet vasodilatateur des substances végétales: Application sur une artère précontractée en présence ou en absence dendothélium. Exemple de lacétylcholine entièrement endothélium dépendante. AChbullesACh Bulles: le passage de quelques bulles dair dans la lumière de lartère enlève lendothélium

36 1. J. Peyroux M. Sternberg, Pathologie Biologie. 2006, 54,

37 Rinçage Test anti-AGEs sur Extraits bruts

38 - Développement et automatisation dun criblage adapté aux extraits végétaux immobilisation de lalbumine au fond des plaques 96 puits rinçage des interférents possible Test anti-AGEs sur Extraits bruts Doctorat co-encadré PCDA/SONAS


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