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TP 6 Dosage de la tyrosinase et influence des effecteurs enzymatiques.

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1 TP 6 Dosage de la tyrosinase et influence des effecteurs enzymatiques.

2 Situation des prélèvements. Léchantillon A provient de la cheminée dun ancien volcan. Léchantillon B a été recueilli sur les pentes dun « pic » qui résulte sans doute de limpact dun astéroïde de grande taille au pôle sud. Léchantillon C a été ramassé sur la plaine équatoriale. Celle-ci présente de nombreuses marques dimpacts de météorites.

3 Situation des prélèvements. Ils ont été passés au spectromètre de masse. Cela a permis de mettre en évidence des traces de huit acides aminés. Ce nest pas surprenant en soi, mais comparez les trois profils et dites ce que lon peut en déduire. Léchantillon A provient de la cheminée dun ancien volcan. Léchantillon B a été recueilli sur les pentes dun « pic » qui résulte sans doute de limpact dun astéroïde de grande taille au pôle sud. Léchantillon C a été ramassé sur la plaine équatoriale. Celle-ci présente de nombreuses marques dimpacts de météorites.

4 Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons. -- La Tyrosinase est une enzyme qui catalyse la formation des pigments dans les mélanocytes de la peau et les follicules pileux. On lappelle tyrosinase car la première étape consiste en la transformation de la tyrosine. Elle est aussi présente chez les végétaux, mais on ne sait pas trop à quoi elle sert. Elle provoque le brunissement des fruits et des légumes en présence de dioxygène. -- Si nous mettons en évidence une activité tyrosinase, nous aurons démontré quil existe un métabolisme complexe sur cette planète naine. -- Et la présence de vie ? -- Métabolisme ne veut pas dire nécessairement vie. Mais cest une première étape.

5 Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons. -- La méthode la plus simple est celle qui utilise le 4MC. Elle se base sur le principe que la tyrosinase est une enzyme relativement peu spécifique. Elle reconnaît plusieurs substrats différents qui possèdent une analogie de structure avec les 2-diphénol. Elle catalyse la réaction ci-contre: 1. Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC). -- Le 4 Méthyl catéchol (4 MC) correspond à cette catégorie. Lorsquil subit la réaction, il donne un produit coloré, la quinone:

6 Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons. 1. Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC). -- On commence par une cinétique pour tester la valeur de dilution de lextrait. On prépare le mélange réactionnel : - 1,5 mL de tampon acétate - 1 mL de 4 MC à 5 mmol.L-1 - 2,8 mL d'eau On ajoute 0,2 mL d'extrait à t = 0 s et on note l'absorbance à 400 nm à t = 15 s et t = 135 s. Si cette dernière est comprise entre 0,8 et 1,2 cest bon. On peut lutiliser. Si elle est supérieure, On le dilueras et on recommence le test. On ne teste quun seuk échantillon, celui qui est le plus pertinent Cinétique préliminaire. -- Ensuite, on laisse la réaction aller à son terme. Lorsque l'absorbance ne varie plus, on note labsorbance et on évalue la valeur de.quinone. Déterminer léchantillon à tester ! Déterminer et justifier la méthode de calcul !

7 Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons. 1. Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC). -- Pour la détermination des paramètres, on suit les instructions du tableau. On utilise les données de la cinétique pour choisir une dilution adéquate de lextrait Détermination des paramètres enzymatiques. Vérifier que la cinétique est linéaire entre 15 et 135 s. 0IIIIIIIV Tampon acétate (µL)550 4MC (à 5 mmol.L -1 ) (µL) pré-incubation à 37°C directement dans une micro-cuve. H2OH2O qsp 2 mL (après addition de lextrait) Extrait A, B, et C (µL)100 Tampon d'arrêt2 mL Comparer les échantillons et conclure. - Mélanger par retournement. - Suivre absorbance à 390 nm pendant 5 mn

8 Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons. -- Il serait intéressant de comparer ces résultats avec ceux dune méthode voisine. Nous nous contenterons de lextrait E-A. Nous allons utiliser le catéchol comme substrat. Contrairement à son dérivé, le 4-MC, il possède un pic dabsorbance à 265 nm. 2. Méthode « catéchol 265 » (pour information). -- Il ne suffit plus que dappliquer le protocole décrit par le tableau. IIIIIIIV ac ascorbique (5 mmol.L -1 )50 EDTA (0,065 mmol.L -1 )50 Catéchol (5 mmol.L -1 ) Tp pH 6,5 qsp 3 mL (après addition de lextrait) Solution de conversion UV100 pré-incubation 5 mn à 25°C (si possible) Evaluer la vitesse spontanée de la réaction extrait E-A (µL)50 Ne pas faire le zéro - Mélanger par retournement. - Suivre absorbance à 430 nm pendant 5 mn - On définit une unité de tyrosinase comme la quantité qui provoque une diminution dabsorbance de 0,001 uA par minute dans ces conditions opératoires. Il faut faire un essai préliminaire (avec quel tube ?) pour vérifier que le volume de la prise dextrait est bien adapté et déterminer si une dilution est nécessaire. La solution de conversion permet de modifier labsorbance de la solution. Des UV elle passe dans le visible.

9 Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons. -- La méthode à la DOPA utilise le substrat naturel de la tyrosinase. Lavantage est que lon connaît de du dopachrome ( = mol -1.L.cm -1 ) -- Le protocole est particulièrement simple à suivre. IIIIIIIV DL DOPA (20 mmol.L -1 ) Tp pH 6,5 qsp 3 mL (après addition de lextrait) pré-incubation 5 mn à 25°C (si possible) Evaluer la vitesse spontanée de la réaction extrait E-A (µL)? - Mélanger par retournement. - Suivre absorbance à 405 nm pendant 3 mn La variation dabsorbance doit être comprise entre 0,03 et 0,3 uA.mn -1. La période de linéarité est alors inférieure ou égale à 3 mn. Au-delà, un brunissement du milieu réactionnel est normal. La encore il faut faire un essai préliminaire pour déterminer le volume de prise dessai et la dilution éventuelle. 3. Méthode « DL DOPA 475 » (pour information).

10 Influences environnementales. Cest un agent réducteur puissant capable dinhiber un certain nombre denzyme. 1. Effet du méta-bisulfite. En quoi un réducteur peut-il interférer sur le pouvoir catalytique de la tyrosinase. Vol en mL0IIIIIIIV Tampon acétate (µL)550 4MC (à 5 mmol.L -1 ) (µL) Méta-bisulfite de Na : (0,25 mmol.L -1 ) (en µL) pré-incubation à 37°C directement dans une micro-cuve. H2OH2O qsp 2 mL (après addition de lextrait) Extrait E-A (µL)100 tampon d'arrêt2 mL noter l'absorbance à t = 15 s. et à t = fin de linéarité (135 s) Quand on analyse globalement la manip, on se rend compte quil nest pas obligé de préparer tous les tubes décrits dans le tableau.

11 Influences environnementales. -- Nous devons tester le prélèvement C qui contient de lacide cinaminique. Quand on voit la molécule, on devine par quel mécanisme il peut bloquer le fonctionnement de lactivité tyrosinase. 2. Effet du cinaminate. Développer cette argumentation. -- Le principe de la manipulation est le même que pour le prélèvement B. On garde le bocal et on change les cornichons ! Vol en mLIIIIIIIV Tampon acétate (µL)550 4MC (à 5 mmol.L -1 ) (µL) ac cinaminique (3 mmol.L -1 ) (en µL) H2OH2O qsp 2 mL (après addition de lextrait) Extrait E-A (µL)100 Tampon d'arrêt2 mL noter l'absorbance à t = 15 s. et à t = fin de linéarité (135 s)

12 -- Il ne me reste plus quà taper le rapport. -- Quest-ce quon y attend exactement ? -- Tous les calculs de vitesses justifiés par les choix de manip. Lanalyse comparée de ces résultats et les conclusions. La routine, quoi.


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