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Décembre 2007Virologie1 Diagnostic des viroses. décembre 2007Virologie2 Introduction Le diagnostic est avant tout clinique. Pourquoi (ou pour qui) aller.

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1 décembre 2007Virologie1 Diagnostic des viroses

2 décembre 2007Virologie2 Introduction Le diagnostic est avant tout clinique. Pourquoi (ou pour qui) aller plus loin en mettant en évidence le virus (direct) ou un stigmate du virus (indirect) ? : affirmer le rôle effectif d un virus pour des patients immunod é prim é s de fa ç on à pouvoir traiter ou pr é voir l é volution de la maladie, d é tecter la pr é sence effective du virus pour é viter la virose (prophylaxie pour : greffons, transfusions, rub é ole pour les femmes enceintes, sida pour les sexuellement actifs … ) surveiller une é pid é mie et pr é parer les futurs vaccins.

3 décembre 2007Virologie3 1.Mise en évidence du virus

4 décembre 2007Virologie4 1. Mettre en évidence le virus 1.1. Par microscopie électronique

5 décembre 2007Virologie Par immunolatex, immunofluorescence, immunochromatographie ou immunoenzymologie

6 décembre 2007Virologie6 a. Recherche RT-PCR Identification Détection des Norwalk- like par RT-PCR Fabienne Loisy, Pierre Le Cann, Monique Pommepuy Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer - Direction de l'Environnement et de l'Aménagement Littoral Département Microbiologie et Phycotoxines, BP 21105, Nantes Cedex 3, France RNA extraits incluant le RNA viral recherché Captation des RNA viraux spécifiques par une sonde biotynilée, fixée sur une bille magnétique streptavidinylée Purification par lavage du RNA viral : laimant permet de récupérer spécifiquement la sonde. Transcription inverse du RNA viral puis Amplification par RT-PCR avec les amorces, les enzymes RT MuL V et DNA polymérase. Lamorce est la sonde Détection des amplicons classique. RT-PCR : Amplification dun RNA en DNA par transcription inverse en cDNA suivi dune amplification classique Par des techniques de biologie moléculaire

7 décembre 2007Virologie7 Fonctionnement de la PCR en temps réel : La plupart des PCR quantitatives (temps réel) sont basées sur la mesure démission de fluorescence proportionnelle à la quantité de gènes amplifiés. Plusieurs techniques existent : elles utilisent soit des molécules se liant à l'ADN, soit des sondes moléculaires spécifiques de la cible amplifiée. Un seul exemple est développé. (voir notamment le site Pour compléments) b. PCR quantitative (dite en temps réel)

8 décembre 2007Virologie8 Un exemple dutilisation de sondes : La fluorescence est obtenue par lutilisation dune sonde marquée. Le but est de faire apparaître la fluorescence de manière proportionnelle à la quantité d'ADN cible présent. Deux marqueurs sont nécessaires : un marqueur R (reporter) émetteur de fluorescence et un marqueur Q (quencher) qui absorbe cette fluorescence lorsque R et Q sont proches. Lorsque Q et R sont séparés soit par hydrolyse de la sonde, soit lors de lhybridation des amorces, soit lors de la synthèse du brin complémentaire, la fluorescence de R nest plus absorbée. La mesure de la fluorescence est donc proportionnelle au nombre d'ADN produits par la PCR, lui même proportionnel au nombre d'ADN cibles présents au départ. L'utilisation de sondes spécifiques de l'ADN cible recherché permet d'obtenir une très grande sensibilité

9 décembre 2007Virologie9 Les courbes obtenues ont cette allure : Intensité de fluorescence Cycles de PCR Exemple dapplication médicale : dosage de HCV dans le sérum.

10 décembre 2007Virologie Mise en évidence du virus par culture problèmes de SÉCURITÉ Technique : prélèvement : écouvillons en gélose Charbon, aspirations ou sécrétions dans du milieu de Hanks, selles Conserver à 4°C culture sur MRC5 ou Véro après décontamination microbienne. Addition possible danticorps connus pour étudier linhibition de la culture en parallèle à la culture. examen des cultures pour déterminer les effets cytopathologiques (cytopathiques).

11 décembre 2007Virologie11

12 décembre 2007Virologie12

13 décembre 2007Virologie13 2. Mise en évidence ou titrage danticorps

14 décembre 2007Virologie introduction Intérêt : rapide économique dangers virologiques faibles Inconvénients : fenêtre de s é ron é gativit é nécessite parfois deux prélèvements successifs et un titrage

15 décembre 2007Virologie techniques Techniques classiques : immunoenzymologie immunofluorescence fixation du complément, inhibition de lhémagglutination… Techniques particulières : neutralisation de lECP du virus par le sérum du malade western blot


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