La cytologie Elle concernent

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1 La cytologie Elle concernent
·      les étalements, frottis et smears (écrasement et étalement de tumeur par exemple pour obtenir un couche monocellulaire) qui seront fixeés par des fixateurs déshydratants spray ou bain d’alcool.  Ces techniques ne donnent pas accès à l'intérieur des cellules ·      Les liquides, urines, cytoponctions qui seront cytocentrifugés pour projeter le matériel cellulaire sur une lame de verre. Ces lames sont ensuite fixées par fixateurs déshydratants. On peut avoir besoin d’étudier des coupes de culot cellulaire (immunomarquage de l’intérieur de cellules isolées) on réalise, par centrifugation alors un culot de cellules fixées au formol ou au paraformaldéhyde. Ce culot est ensuite préenrobé en gélose puis inclus et traité comme une petite biopsie.

2 La circulation Au cours de cette étape on remplace progressivement le milieu aqueux cellulaire par le milieu d’inclusion (ou d'imprégnation ). Le milieu d'inclusion le plus utilisé, en histologie, est la paraffine, on peut également utiliser certaines résine acrylique. Ces milieux sont hydrophobes, le milieu d'enrobage ne pourra pas pénétrer dans le tissu très hydraté. Il faudra faire subir un certain nombre de traitements à l'échantillon avant de pouvoir obtenir une coupe correcte et notamment le faire passer dans plusieurs bains de solvants intermédiaires miscibles à la fois à l'eau et au milieu d'inclusion au cours de la circulation La circulation peut être réalisée manuellement mais si on a un grand nombre de prélèvements a traité, on utilise un automate de circulation qui fait passer les échantillons dans les différents bains. Toutes ces étapes sont réalisées avec une agitation constante pour permettre un mélange plus homogène des liquides et une meilleurs pénétration des liquides. Après le bain de formol le processus se déroule sous vide (élimination de l'air => meilleure pénétration) Le premier bain est un bain de formol, ensuite commence la déshydratation.

3 La déshydratation:  C'est la première étape de la circulation, elle consiste à retirer l'eau du prélèvement et à la remplacer par l'agent déshydratant. Les agents déshydratants: L'idéal serait d'utiliser un agent miscible à l'eau et à la paraffine ce qui n'est pas réalisable en pratique. (ex dioxyde d'éthylène cher très toxique très inflammable) Le plus utilisé en histologie: Ethanol C2H5OH Il provoque un durcissement important et n'est pas miscible à la paraffine, on doit compléter son action par un autre solvant intermédiaire Peu toxique il est inflammable et volatil

4 Acétone CH3CHO Permet une déshydratation plus rapide mais provoque un durcissement important. Il est utilisé lors d’une inclusion avec certaines résines Alcool isopropylique CH3CHOHCH3 plus lent et plus tolérant que l'acétone il rétracte moins les tissus Procédure de déshydratation: Le tissu est d'abord transféré dans un bain à 95% d'alcool, un passage direct dans l'alcool pur entraînerait une grande distorsion des structures.  Suivi de 2 autres bains alcool à 95% Puis 3 bains à100% afin d’éliminer le mieux possible l’eau du milieu cellulaire.

5 Les agents éclaircissant
Problèmes engendrés par une mauvaise déshydratation: Déshydratation prolongée => durcissement excessif Déshydratation insuffisante => la paraffine ne pénètre pas de manière homogène. On aura des difficultés de coupes ( vibrations arrachages) Avec le temps et l’évaporation, le bloc se rétracte on aura des structures déformées entraînant des difficultés d’interprétation Éclaircissement L’agent déshydratant est remplacé par un agent miscible à celui-ci et à la paraffine au cours de la procédure d’éclaicissement. Ces solvants ont un indice de réfraction proche de celui des protéines et le tissu devient transparent d’où leur nom d’agent éclaicissants. Les agents éclaircissant Les plus connus sont les hydrocarbures aromatiques

6 Hydrocarbures aromatiques Benzène Toluène Produits très toxiques
Agent éclaircissants. Hydrocarbures aromatiques Benzène Toluène Produits très toxiques Xylène On utilise plutôt des composés aliphatiques type HISTOSOL contiennent des solvants organiques et Cl Cl C = C Cl Cl CH3

7 Problèmes engendrés par un mauvais éclaircissement
Un éclaircissement mal conduit entraînera des effets similaires à ceux d’une mauvaise déshydratation C\ Imprégnation Le milieu le plus utilisé est la paraffine et ses dérivés, peu coûteux et d’emploi facile le dernier bain de circulation est un bain de paraffine chaude miscible à l’agent éclaircissant. On peut traiter de manière standardisée un très grand nombre de pièces dans un laps de temps court. La paraffine permet une très bonne conservation des tissus en blocs solidifiés. La coupe et la coloration se font très facilement. le dernier bain de circulation est donc un bain de paraffine liquide (le point de fusion du milieu varie de 50 à 60°C selon le type de paraffine).

8 Imprégnation paraffine
La circulation Échantillon fixé Non compatible H2O Compatible Compatible Non compatible ETHANOL HISTOSOL Compatible

9 Résumé : Du prélèvement à la coupe
biopsie liquide congélation Fixation Choix du fixateur Inclusion paraffine coupe acétone Organe grosse pièce échantillonnage Cyto centrifugation alcool Préenrobage gélose frottis Fixation formol