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Anomalies des gènes et leur exploration Alain Hovnanian Service de Génétique Médicale Hôpital Purpan Tél: 05 61 77 90 79 05 62 74 45 00.

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1 Anomalies des gènes et leur exploration Alain Hovnanian Service de Génétique Médicale Hôpital Purpan Tél:

2 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

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5 MUTATIONS Définition: Modification du matériel génétique (maladie/polymorphisme). Variation de séquence héréditaire ou acquise Origines: - Spontanées (endogènes) (1): - Anomalies de la réplication de l ADN - les plus fréquentes (10 -6 paires de bases par génération) - erreurs de lADN polymérase (erreur de lecture conduisant à des mésappariements ou mismatch) - favorisées par les séquences répétées - Accidents de recombinaison méiotique - surviennent lors de la méiose - favorisés par des séquences d homologie entre chromosomes - délétions, duplications, recombinaisons illégitimes

6 Origines des mutations (suite): - Spontanées (2): - Déamination, en particulier de cytosine méthylée - très fréquent en pathologie humaine - non reconnu par les systèmes de réparation de l ADN - ex: Arg CGA -> Stop TGA - Dépurination - Espèces oxygène réactives (ion O 2 - superoxide, radicaux libres) - Provoquées (extérieurs): - agents génotoxiques - 3 types:. chimiques (hydrocarbones, chimiothérapie),. physiques (radioactivité naturelle et autres rayons ionisants, UV). biologiques (virus) - normalement corrigés au cours de la réplication par les systèmes de réparation de l ADN - déficients dans certaines maladies génétiques (ex: xéroderma pigmentosum…)(cancers)

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8 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

9 Types de mutations A - Mutations ponctuelles B - Insertions ou délétions de plusieurs bases C - Expansions de triplets (mutations instables) D - Macrolésions

10 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

11 A - Mutations ponctuelles Les plus fréquentes, extra ou intra-géniques, polymorphismes (RFLP, SNPs) ou mutations responsables de maladies génétiques 1 - Substitutions de base Définition: remplacement d un nucléotide par un autre Leur effet dépend de leur nature et position dans le gène: - régions codantes: - mutation silencieuse - mutation faux-sens - changement d un acide aminé par un autre - conservatrice (acide aminé de même classe) ou non conservatrice - mutation non-sens - changement d un acide aminé en un codon stop prématuré (TAA, TGA, TAG)

12 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

13 1 - Substitutions de base (suite) - régions codantes: cas particuliers: - codon d initiation de la traduction - codon de terminaison de la traduction - séquences « Exonic splicing enhancer » (-> anomalie d épissage) - mutation non-sens entraînant le saut de l exon correspondant (-> rétablissement de la phase)

14 1 - Substitutions de base (suite) - régions non codantes: - introns: - sites consensus d épissage (site donneur gt, site accepteur ag) - sites non consensus d épissage - site de branchement - conséquences: -> saut d exon -> rétention d intron -> activation d un site cryptique d épissage, exonique ou intronique - séquences régulatrices en amont du gène -> anomalies de régulation de la transcription - séquences 3 UTR -> instabilité de l ARNm

15 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

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18 Exemples anomalies d épissage gt ag c gt ag a gt ag stop gt Saut d exon Activation d un site cryptique d épissage Saut d exon

19 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

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21 Conséquences possibles des mutations de la région 3UTR

22 2 - Délétion ou insertion d une base - régions codantes: entraînent un décalage du cadre de lecture (« mutations décalantes ») conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré - régions non codantes: selon leur localisation: - région promotrice; anomalie transcription - sites d épissage: anomalie d épissage - région 3 UTR: instabilité ARNm

23 B - Insertion ou délétions de plusieurs bases (micro-délétions ou micro-insertions) Perte ou ajout de plusieurs bases - régions codantes: - Si multiple de 3: perte ou ajout d un ou plusieurs acides aminés - Si non multiple de 3 entraînent un décalage du cadre de lecture conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré - régions non codantes: selon leur localisation: - région promotrice: anomalie transcription - sites d épissage: anomalie d épissage - région 3 UTR: instabilité ARNm

24 6081del del27 Délétions génomiques de COL7A1 dans lEBD dominante

25 Conséquences des mutations Mutation respectant le cadre de lecture: - ex:. mutation faux-sens, insertion ou délétion multiple de 3,. anomalie d épissage respectant ou rétablissant la phase - conduisent à la synthèse d une protéine anormale présentant: - le remplacement d un acide aminé par un autre - la perte ou le gain d un ou plusieurs acides aminés -> protéine produite, mais stabilité et/ou fonction compromises

26 Conséquences des mutations (suite) Mutation interrompant le cadre de lecture: - ex: mutations non-sens, insertion ou délétion non multiples de 3 - conduisent à un codon stop prématuré pouvant entraîner: - instabilité de l ARNm muté (NMRD) - synthèse d une protéine tronquée ayant une extrémité COOH anormale - synthèse d une protéine amputée d une séquence peptidique (saut d exon portant un PTC) -> protéine non produite, ou instable et/ou non fonctionnelle

27 C - Expansions de triplets (mutations instables) - Répétitions instables de triplets nucléotidiques - Nature, nombre, localisation (région codante/non codante) variables - Souvent maladies neuro-dégénératives - Le plus souvent transmission autosomique dominante - Exemples Syndrome de l X fragileCGG5 UTR XRXq27 Dystrophie myotonique de SteinertCTG3 UTR AD19q13 Chorée de HuntingtonCAGcodante AD4p16 Ataxie de FriedreichGAAintron 1 AR9q13

28 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005 Mutations dynamiques (expansion de triplets)

29 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

30 D - Macrolésions - Conséquences délétères en pathologie et au cours de l évolution - Délétions de quelques centaines à plusieurs milliers de pb - Duplications - Fusion de gènes suite à une double cassure de l ADN (ex. translocation) - Inversions de gènes (orientation tête-bêche d un fragment d ADN)

31 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

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33 Stratégies de recherche d anomalie des gènes (Maladie et gène connus +++) Analyse directe Mutation connue de petite taillede grande taille PCR - Enzyme de restriction - Hybridation spécifique d allèles - Séquençage Longue PCR ou - Southern-blot

34 Identification d une mutation non sens de COL7A1 par séquençage Arg->Stop CGA -> TGA EB Mère Père Tropho Arg->Stop CGA -> TGA

35 Analyse directe (1) Mutation inconnue PCR Détection: - SSCPSingle strand conformational polymorphism - DGGEDenaturing gradient gel electrophoresis - CSGEConformation sensitive gel electrophoresis - DHPLC: Denaturing High Performance Liquid Chromatography Identification: - Séquençage +++

36 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

37 Technique du SSCP

38 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

39 Principe des techniques du DGGE, CSGE et DHPLC

40 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005 Technique du DGGE

41 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005 Technique du DGGE

42 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

43 Détection de mutation de COL7A1 par DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) Pic d élution anormal

44 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005 PCR multiplex

45 Analyse directe (2) Macrolésions CytogénétiqueBiologie moléculaire - Hybridation sur chromosome (FISH, Fluorescent in situ hybridization) - Southern-blot - PCR: Perte d hétérozygotie Défaut d amplification de l ADN

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49 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

50 Technique du Southern blot

51 Analyse indirecte Etude de marqueurs génétiques polymorphes: - intra-géniques ou flanquant le gène - microsatellites ou bi-alléliques RFLP: Restriction fragment length polymorphism SNPs: single nucleotide polymorphism

52 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

53 A 3p21 COL7A48,948-48,980 PvuII D3S1581 D3S1568 D3S158854, Mb D3S ,88 D3S ,47-48,91 48,985 49,48 Distance physiqueMarqueurs génétiques Centromère Télomère Etude de liaison génétique utilisant les marqueurs de COL7A1 Chromosome 3

54 Père Mère Enfant atteint d EB récessive Génotypage de marqueurs de COL7A1

55 Père atteint Mère Enfant atteint d EB dominante familiale Génotypage de marqueurs de COL7A1

56 PèreMère Enfant EBDREnfant sainTrophoblaste Porteur sain Diagnostic prénatal d EBDR par étude indirecte (marqueurs de COL7A1)

57 ADN Génotypage (marqueurs de COL7A1) et Recherche de mutations de COL7A1 COL7A1 amplifié Sang Diagnostic moléculaire des EB dystrophiques Vérification des mutations

58 Exemples de conséquences des mutations Codons stop prématurés Instabilité ARNm Protéine non produite Allèle nul (perte de fonction) Maladies récessives Maladies dominantes (par haploinsuffisance) Mutations faux-sens Protéine qualitativement anormale Stabilité variable Fonction anormale (diminution, perte ou nouvelle fonction) Maladies récessives Maladies dominantes (par effet dominant négatif) Mutations dépissage

59 Quelques définitions (1) Allèle: forme alternative au locus dun gène Allèle nul: allèle qui ne produit pas de protéine Allèle hypomorphe: allèle qui produit une quantité réduite de la protéine ou une protéine moins active Allèle néomorphe: allèle dont le produit a une nouvelle activité Allèle antimorphe: allèle dont le produit antagonise lactivité du produit normal Disomie uniparentale: les deux copies dun même chromosome viennent dun seul parent Empreinte: expression différentielle et réversible dun gène selon lorigine parentale Epigénétique: modifications de lADN sans altération de sa séquence (ex. méthylation de lADN, acétylation des histones) Epistasie: intéraction de plusieurs gènes pour produire un phénotype

60 Quelques définitions (2) Haploinsuffisance: le produit dun seul allèle est actif, mais en quantité insuffisante pour une fonction normale Haplotype: groupes dallèles transmis ensemble Hémizygote: présence dun gène en une seule copie Hétérozygote: deux allèles différents dun même gène Homozygote: deux allèles identiques dun même gène Méthylation: addition dun groupement méthyle (-CH3) à certains nucléotides (surtout la cytosine) interférant avec la transcription Microsatellites: séquence de un à 10 nucléotides répétés en tandem, souvent polymorphes Multifactoriel: résultant de linteraction de facteurs environnementaux et génétiques multiples Transition: remplacement dune purine (A, G) en lautre, ou une pyrimidine (C, T) en lautre Transversion: remplacement dune purine (A, G) en une pyrimidine (C, T), ou dune purine en une pyrimidine

61 Nomenclature des mutations Mutations faux-sens: ex: c.1784G>A ou p.Gly551Glu Mutations non-sens: ex: c.1626C>T ou p.Arg542X Mutations d épissage: ex SD: c.621+1G>A ex SA: c.622-2A>C Délétion : ex. en phase: c.1522_1524del ou p.Phe508del (« del » après 1er et dernier éléments délétés) Insertion: ex. décalante: c.409_410insC ou p.Glu137ProfsX17 (« ins » après les éléments encadrants linsertion, suivi des nucléotides insérés) Insertion/délétion: ex: c.112_117delinsTG (ou c.112_117delAGGTCAinsTG) Génotypes: ex: [p.Phe508del] + [p.Gly551Glu] hétérozygote composite ex: [p.Phe508del] + [=]hétérozygote

62 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

63 Mosaïcism

64 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005 Anomalies de lempreinte parentale

65 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005 Maladies mitochondriales

66 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005 Un gène = une maladie

67 Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005


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