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Publié parCorentin Laurent Modifié depuis plus de 9 années
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Vecteurs synthétiques : SyntheGeneTransfer et Méganucléases Applications à la thérapie génique
Tours le 23 oct 2008
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Gene Therapy La thérapie génique est une stratégie thérapeutique qui consiste à faire pénétrer des gènes dans les cellules ou les tissus d'un individu pour traiter une maladie. La thérapie génique vise à remplacer ou complémenter un allèle mutant défectif par un allèle fonctionnel ou à surexprimer une protéine dont l'activité aurait un impact thérapeutique.
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Différentes Approaches pour la Thérapie Génique
Addition = Insertion du Gène dans un autre locus * Mutation insertionnelle * Activation d’oncogènes * Extinction du transgène transgène choix du locus, du tissu * Intégration aléatoire Complémentation Intégration ciblée 2. Remplacement = Correction du Gène sur son locus Intégration ciblée
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HR & TG HR et TG = échange d’informations génétiques entre une séquence endogène sur un chromosome et une séquence exogène d’ADN (plasmide). Qq 100 pb d’homologie entre la séquence cible et le locus Des extrémités d’ADN libres = ADN db coupure => stimulation du processus ADN db coupure = signal pour la machinerie HR TG Gene targetting
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Homologous Recombinaison
Réparation de l’ADN : coupure d’ADN double brin (DSB) S Undamaged DNA (Allele S) DSB Created (spontaneous or induced, e.g. by ZFN ) Strand Invasion into Undamaged Homologous DNA (Allele A) In gene targeting exogenous DNA serves as homologous DNA donor. Repairing of original strands of DNA. Gaps filled by DNA polymerase and nicks sealed by DNA ligase. Conversion of White Allele(“S”) into Red Allele (“A”) in region of DSB A A
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Homologous Recombinaison
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Homologous Recombinaison
transposition 3’ Néo 3’ HSV-TK GcvR GcvS recombinaison
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Homologous Recombinaison
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Réparation de l’ADN NHEJ Non Homologous End Joining
Réparation avec petites erreurs Homologous Recombinaison Réparation sans erreurs van Attikum & Gasser Nature Reviews, Molecular Cell Biology 2005, 6 :
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HR & TG 100 % efficacité Saccharomyces cerevisiae Trypanosoma brucei
Phycomitrella patens Chicken DT40 lymphoid cell line Qq souches E. coli 100 % efficacité Trypanosoma brucei protozoaire responsable de la maladie du sommeil Phycomitrella patens mousse en séquençage 0,5 billions de pb Dans les autres cellules : HR est inefficace 10-7 à 10-5 - Murine Embryonic Stem Cells 1/100 à 1/1000
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Développement d’alternatives
1 - Correction par de petits oligonucléotides : mutation ponctuelle TFO triplex forming oligonucleotides RDO RNA-DNA oligonucleotide Kolb Trends Biotechnol 2005 SFHD short fragment homologous replacement 2 - Sequence-specific endonucleases = MEGANUCLEASE Correction ou insertion
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18 pb parfait pour créer une seule coupure dans le génome (418)
MEGANUCLEASE story 1980 découverte de HO et I-SceI Endonucléases de levure Initie HR à un locus spécifique I-SceI codée par un intron mitochondrial Copie l’élément dans un seul locus : HOMING 18 pb 18 pb parfait pour créer une seule coupure dans le génome (418) 46 pour les enzymes de restriction
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MEGANUCLEASE story Domaine de liaison à l’ADN = domaine de coupure
Elles sont codées par des éléments génétiques mobiles comme les introns de classe I ou les intéines, qui promeuvent leur propre dissémination par leur activité d'endonucléase. Domaine de liaison à l’ADN = domaine de coupure
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MEGANUCLEASE story Méganucléase = endonucléase site >12pb
Méganucléase naturelle = Homming endonuclease Méganucléase artificielle = Zing finger. Familles de protéines eucaryotes, bactéries et archébactéries, végétaux Pas chez les métazoaires animaux pluricellulaires
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GFP Gene Targeting System
37GFP-IRES-CD8 37GFP-IRES-CD8 CMV/CBA-GFP*-IRES-CD8a-PGK-Neo Stop-Sce Site 327
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Spontaneous Gene Targeting
CMV/CBA-GFP-IRES-CD8a-PGK-Neo Rate= 7.1 x 10-7 (Approximately 1 per million)
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DSB-Mediated Gene Targeting
37GFP-IRES-CD8 CMV-Sce 37GFP-IRES-CD8 Stop-Sce Site CMV/CBA-GFP*-IRES-CD8a-PGK-Neo Stop-Sce Site Cellules de mammifères
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DSB-Induced Gene Targeting
CMV/CBA-GFP-IRES-CD8a-PGK-Neo Optimized Rate of DSB Mediated Gene Targeting= 3-5 x 10-5 à-2 (3-5%) (or 30-50,000 per million) Problèmes : Insertion aléatoire Réparation des jonctions efficace d’un seul côté Localisation DSB et correction (< 500pb) Pas de site I-SceI naturel chez les mammifères Les méganucléases fonctionnent chez les mammifères
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Méganucléase & CO + 100 candidats
Mais le répertoire des séquences cibles ne rend pas compte de la complexité des génomes DAGLIDADG His-Cys box Engineering des protéines mais extrêmement complexe Manque informations structurales et de méthodes
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How to create that DSB?
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Possible Ways to Create a Gene-Specific DNA Double-Strand Break
Non-specifically (ionizing radiation, bleomycin. . .) DNA cleaving ribozyme? Modified Polyamide or Peptide Nucleic Acid Zinc finger proteins Aventure des ZFP Modified homing endonuclease. Not the purpose
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Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP
Motifs les plus répandus dans les domaines de liaison à l’ADN (TFs) - 30 AA organisés en une structure stabilisée par un ion Zn2+ Grand sillon de l’ADN - Chaque ZF reconnaît un triplet de nucléotides
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Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP
Les ZF Cys2His2: de nombreux avantages Chaque ZF reconnaît un triplet de nucléotides Fonctionnement modulaire de la protéine - Les ZF sont assemblables entre eux pour former des protéines polydactiles avec de nouvelles spécificité de reconnaissance.
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Nous avons la spécificité comment créer la coupure?
Les ZFPs peuvent être fusionnées à un domaine effecteur
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Création d’une Zinc Finger Nucleases
= le domaine de coupure de FokI + domaine de reconnaissance de l’ADN de ZF FokI nuclease domain (Fn) Initially developed by labs of Srinivasan Chandrasegaran (Johns Hopkins) and Dana Carroll (Univ. Utah)
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SANGAMO
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SANGAMO
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“Sure, but how to create that gene specific DSB?”
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Zinc Fingers Seem to Bind DNA in a Modular Fashion
FokI nuclease domain (Fn)
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Preuve de concept GFP Donor G FP ZFN Full Site/Sce Site GFP* CD8
CMV/CBA IRES WRE tGFP Sce or ZFN Expression Plasmid Témoin le donneur GFP seul GFP Donor CMV/CBA G FP CD8 IRES WRE tGFP GFP CD8 CMV/CBA IRES WRE (G2/M) 3% of asynchronously cells Le donneur GFP + le plasmide ZFN
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Hah, reporter genes are fine, but show me an endogenous target.
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Mutations in IL2RG Gene that Cause SCID
Stratégie ZFP Urnov et al. (2005) 24 pb; 4 ZFP de part et d’autre du hotspot Stratégie IL2R
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Experimental Design to Detect Targeting at Endogenous IL2RG Locus
Transfect K562 cells with IL2RG ZFNs with repair substrate that contains BsrBI polymorphism. Isolate individual clones (no selection). Expand individual clones (no selection). Harvest genomic DNA from individual clones. Analyze genomic DNA for BsrBI polymorphism.
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Single-step Homozygous Gene Targeting in Somatic Cells (K562)
Correction monoallèlique Correction biallèlique 20% Correction Urnov et al. (2005)
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Next In vivo Ex vivo Essais dans d’autres types cellulaires
Essais pour d’autres gènes Sécurité. Existence de DSB à d’autres loci =>instabilité génomique? Immunogénicité des ZFN Toxicité Méthode de délivrance Moins de problèmes Cellules autologues In vivo Ex vivo
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Possible Ways to Create a Gene-Specific DNA Double-Strand Break
Non-specifically (ionizing radiation, bleomycin. . .) DNA cleaving ribozyme? Modified Polyamide or Peptide Nucleic Acid Zinc finger proteins Aventure des ZFP Modified homing endonuclease. Fin des années 90 Not the purpose
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Modified homing endonuclease.
Spécifité et coupure
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Modified homing endonuclease. Fin des années 90
Spécifité et coupure Boost après la cristallisation des premières protéines DAGLIDADG dans la 1ere hélice de His-Cys box I-CreI, I-MsoI, PI-SceI dans le gros sillon Les + compactes, les + connues I-PpoI Courbure de l’ADN cible Interaction directe de qq AA et Ac nuc Les plus intéressantes
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Engineering HE DAGLIDADG
I-CreI Interface de contact protéine/ADN AA cibles symétrie Smith et al NAR 2006
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Engineering HE DAGLIDADG
Modification de certains AA de I-CreI mais conserver palindrome 64 cibles Smith et al NAR 2006
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Engineering HE DAGLIDADG
Screening de nouvelles cibles ADN palindromiques Test de fonctionnalité en levure, coupure de lacZ-, HR, restauration lacZ+ X Levure bleue site cible potentiel Conclusion Folding OK Stabilité OK Coupure OK Mais 9 AA contactent Ac Nucl 209 variants Imposible à cribler
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Engineering HE DAGLIDADG
Découverte d’un fonctionnement en 4 sous modules Cible= patchwork des mutants parentaux Analyse combinatoire en petits sous problèmes = même approche ZFP Essai ciblage du gène RAG1 Recombinaison VDJ Maturation des Ig SCID phenotype
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Engineering HE DAGLIDADG
HE redessinée pour couper une séquence naturelle Efficacité (aussi efficace que I-SceI GT) Toxicité (peu ou pas toxique) Résultats : loci artificiels lignées immortalisées Et dans des cellules primaires et des gènes endogènes ?
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CELLECTIS
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2007
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Perspectives Recombinaison et cycle de division (S/G2)
Recombinaison et accesibilité de la chromatine Quels types de vecteurs? Toxicité due à la perte de spécificité * tolérence de dégénérescence dans le site cible => coupure cryptique = génotoxicité (ZFN+++) * HE ou ZFN fonctionnent sous la forme hétérodimère dans la cellule => formation d’homo et hétérodimère => homo => perte de spécificité solution dans la nature HE homodimere = un polypeptide Engineering ZFN et HE grande avancée pour des applications en thérapie génique… DEMAIN
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I want to stay as close to the edge as I can without going over
I want to stay as close to the edge as I can without going over. Out on the edge you can see all kinds of things you can’t see from the center. -Kurt Vonnegut
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Réparation de l’ADN van Attikum & Gasser Nature Reviews, Molecular Cell Biology 2005, 6 :
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2 voies de réparation Avec homologie Sans homologie
6 protéines Ku70/86, XRCCA, DNA ligase IV sont conservés de la levure à l’homme MRN sont conservés de la levure à l’homme Protéines ubiquitaires (MRN est partagé par les deux systèmes Lisby et al Biochimie) Lieber et al., 2004 DNA repair;
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L’intervention séquentielle des 3 types de protéines est variable
Nucléase (5’-> 3’) Sérine/Thréonine kinase une fois fixé sur l’ADN, s’autophophoryle et P Artémis Famille polymérase X Nucléase reconnaît les jonctions ss et ds de l’ADN Phosphorylation d’Artémis par ATM et PKc Coupure Libération du site ATM active les protéines de contrôle du cycle cellulaire S et G2/M, indépendantes de la p53 PKc et Ku active l’apoptose via p53 L’hétérodimer Ku70/Ku86 très abondante--> dès l’apparition d’un DSB, Ku se fixe. Sur chaque extrémité Ligase L’intervention séquentielle des 3 types de protéines est variable La structure des extrémités reconnues est variable (5’ ou 3’ débordante, bout franc) La nature des réparations est variable Ma et al., 2005 Cell Cycle; Lieber et al., 2004 DNA repair;
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Toutes les protéines ne sont pas toujours nécessaires
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Ku/PKc n’existe pas en solution
Rapprochement des extrémités Ku? ou Pkc Pour faire la réparation, il faut que l’ADN de la chromatine soit accessible à ces protéines.
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Incorporation de variants d’histones
Pour rendre ADN/nucléosome accessible Modification de la queue des histones acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitination Incorporation de variants d’histones Remodelage de la chromatine par des complexes protéiques ATP dépendant appartenant à la famille swi2/snf2 SWI2 ISWI CHD (hélicase) INO80 Recrutés sur les DSB La modification la plus étudiée est le phosphorylation de l’histone H2AX sur Ser139 par les PIKK (ATM, ATR, PKc). -H2AX recrute les enz de réparation et les enz de contrôle H2AX est incorporée de manière aléatoire dans l’ADN. Des cellules dépourvues des complexes SWI/SNF ne réparent pas l’ADN DSB et la survie cellulaire est affectée. Des cellules dépourvues de H2AX ne réparent pas l’ADN et ne maintiennent pas l’intégrité du génome SWI/SNF complexes facilitent la réparation DSB en permettant la phosphorylation de H2AX. Park et al 2006 EMBO J
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MRN recrute ATM ATM Evite les translocations et les délétions
H2AX phosphorylée par ATM génère des loci -H2AX qui serait le point de nucléation des protéines de réparation NHEJ et HR. -H2AX aurait une fonction d’ancrage des extrémités DSB au travers de ces multiples intéractions afin d’éviter la séparation des extrémités. MRN recrute ATM ATM H2AX -H2AX Se lient et rapprochent les extrémités DSB dans NHEJ et HR Evite les translocations et les délétions Bassing et al., DNA repair 2004
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