T3SS Sécrétion de type III.

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1 T3SS Sécrétion de type III

2 Petite introduction … ¤ qu’est-ce que la sécrétion : c’est quand une protéine est synthétisée dans le cytoplasme et va traverser la membrane pour être libérée dans le milieu extérieur  c’est un transport actif c’est un cas particulier d’export

3 ¤ les différents types de sécrétion :
+ type VI identifiée en 2006 (+ type VII chez les Gram+)

4 La sécrétion de type III
appelée INJECTISOME (machinerie de sécrétion complexe) mise en évidence chez Yersinia (Cornelis, 1997) pathogène d’animaux et phytopathogène complexe macromoléculaire permet l’injection directe de protéines effectrices au travers de la membrane des cellules cibles eucaryotes rôle important dans la virulence  permet l’invasion intracellulaire dans les cellules non phagocytaires, inhibe la réponse proinflammatoire, module le trafic intracellulaire…

5  Les différentes familles d’injectisomes :
Injectisome Family Species Description Chlamydiales *Chlamydia trachomastis Obligate intracellular human pathogen Hrp1 *Pseudomonas syringae Plant pathogen Hrp2 *Burkholderia pseudomalles *Xanthomonas campestris Human pathogen SPI-1 *Salmonella enterica *Shigella flexneri SPI-2 *Escherichia coli EPEC *Yersinia pestis Rodent and human pathogen Rhizobium *Rhizobium sp Plant symbiont Ysc *Yersinia enterocolitica

6  Les différentes familles d’injectisomes :
Injectisome Family Species Description Chlamydiales *Chlamydia trachomastis Obligate intracellular human pathogen Hrp1 *Pseudomonas syringae Plant pathogen Hpr2 *Burkholderia pseudomalles *Xanthomonas campestris Human pathogen SPI-1 *Salmonella enterica *Shigella flexneri SPI-2 *Escherichia coli EPEC *Yersinia pestis Rodent and human pathogen Rhizobium *Rhizobium sp Plant symbiont Ysc *Yersinia enterocolitica

7 Structure du système de sécrétion de type III (Calvin et al., 2006)
différentes familles toutes basées sur le même modèle structural très conservé N E D L C O M P X S T R U C E B A ALE ME tige Partie basale MI Structure du système de sécrétion de type III (Calvin et al., 2006)

8 différentes familles toutes basées sur le même modèle structural très conservé
quand contact : formation d’un pore=translocateur (Yop B, Yop D et Lcrv) + injection des Yop (=effecteurs) mécanisme contact-dépendant transport unidirectionnel en 1 étape dans un état déplié intervention de chaperonnes translocon Partie basale : ATP-ase

9  grande similarité avec le flagelle suggérant une origine commune
Flagelle = organelle mobile. Il s’agit d’un prolongement cytoplasmique comportant 3 parties : corps basal, crochet, filament. Son assemblage est séquentiel, de la partie la + interne à la partie la + externe : insertion du disque M dans la mbne, puis du disque S, addition de la tige et de son capuchon, addition des disques Pet L, addition du crochet et finition, autoassemblage du filament flagellaire par polymérisation de la flagelline et enfin addition des protéines de motilité. b a Figure 2. Structure du flagelle et du SST3. (a) représentation schématique du flagelle (b) représentation schématique du SST3 de la famille Ysc chez Yersinia spp. (Cornelis, 2006)

10  grande similarité avec le flagelle suggérant une origine commune
Injectisome Ysc

11 The Needle Length of Bacterial Injectisomes Is Determined by a
SCIENCE VOL DECEMBER The Needle Length of Bacterial Injectisomes Is Determined by a Molecular Ruler Laure Journet, Céline Agrain, Petr Broz, Guy R. Cornelis* 14 August 2003; accepted 16 October 2003 (La longueur des aiguilles des injectisomes bactériens est déterminée par une règle moléculaire)

12 ¤ Ce que les chercheurs savaient :
 Les protéines de la famille Ysc présentent beaucoup de similarités avec les protéines du corps basal du flagelle (origine commune)  La longueur du crochet du flagelle (55nm) est génétiquement contrôlée  Mutations dans fliK (gène du flagelle de Salmonella) crochets de taille indéfinie  Mutation dans invJ (Salmonella) et dans spa32 (Shigella) aiguilles de longueurs variables  InvJ et Spa32 se comportent comme FliK (pas de séquences homologues) Flagellum Salmonella Injectisome Salmonella Injectisome Shigella Structure/function FliK InvJ Spa32 *Control the hook/needle lenght *Substrate specificity switch

13 « qu’est-ce qui contrôle la longueur des aiguilles chez Yersinia ?? »

14 ¤ Microscopie électronique :
Structures détachées de type aiguille de 60 nm Y. enterocolitica E40 incubée dans un milieu où la sécrétion de Yop a été induite artificiellement

15 ¤ Mesure des aiguilles :

16 ¤ Microscopie électronique :
Y. enterocolitica yscP Δ97-465

17 ¤ taille des aiguilles de Y. enterolica yscP Δ97-465
Tailles comprises en 45 et 1532 nm  YscP joue un rôle dans le contrôle de la longueur des aiguilles de l’injectisome

18 Le contrôle de la taille est restauré
Test de complémentation : yscPΔ yscP+ Le contrôle de la taille est restauré YscP joue une rôle essentiel dans le contrôle de la longueur des aiguilles

19 ¤ on dispose de 3 protéines YscP de tailles différentes :
90% d’identité de séquence avec YscP entero E40

20 ¤ les 3 protéines conduisent-elles à des aiguilles de même taille ???????
Test de complémentation : yscP Δ yscP pestis KIM Résultat : restauration du contrôle de la longueur des aiguilles mais aiguilles de taille + petite YscP E40

21 Test de complémentation : yscP Δ97-465 + yscP Δ222-306
Résultat : -contrôle restauré de la longueur des aiguilles - aiguilles + petites que pour YscP E40 YscP E40

22 Corrélation entre la taille de YscP et la longueur des aiguilles
YscP joue un rôle essentiel dans le contrôle de la longueur des aiguilles Corrélation entre la taille de YscP et la longueur des aiguilles

23 ¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ :

24 ¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ : 1,2,3,4 : corrélation taille de la protéine/longueur des aiguilles

25 ¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ :  6,7,8 : corrélation taille YscP/longueur des aiguilles

26  N-ter important pour le contrôle de la taille
¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ : 9 16-25 10 26-35  N-ter important pour le contrôle de la taille

27  C-ter important pour le contrôle de la longueur
¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ : 11 12  C-ter important pour le contrôle de la longueur

28 ¤ Set de constructions (délétion ou insertion) dans les clones du gène yscP entero et complémentation avec yscP Δ : Relation linéaire entre la longueur des aiguilles et la taille de YscP Hypothèse :YscP est un molecular ruler

29 ¤ Hypothèse : si YscP est un molecular ruler, on pourrait s’attendre à ce que la protéine soit associée à l’aiguille, au moins pendant l’étape d’élongation. ¤ Tester cette hypothèse : purification des aiguilles Y.enterocolitica -condition non-permissive -condition permissive Condition non-permissive : Présence de YscP dans la fraction d’aiguilles et dans le surnageant

30 ¤ Hypothèse : si YscP est un molecular ruler, on pourrait s’attendre à ce que la protéine soit associée à l’aiguille, au moins pendant l’étape d’élongation. ¤ Tester cette hypothèse : purification des aiguilles Y.enterolica -condition non-permissive -condition permissive Condition permissive : Ysc P seulement retrouvée dans le surnageant  YscP est associée au aiguilles nouvellement synthétisées ne sécrétant pas de Yop mais pas avec les aiguilles sécrétant les Yop

31 ¤ YscP joue 1 rôle essentiel dans le contrôle de la longueur des aiguilles
¤ corrélation entre taille de YscP et longueur des aiguilles (relation linéaire) ¤ N-ter et C-ter de YscP importants pour le contrôle de la longueur des aiguilles ¤ YscP = molecular ruler

32 Hypothèse : ¤ les 2 extrémités N et C-ter sont des ancres protéiques : 1 attachée au corps basal, l’autre attachée à l’extrémité grandissante de l’aiguille. ¤ quand l’aiguille atteint sa taille mature (60nm), YscP complètement tendue signalant via 1 domaine l’arrêt de sécrétion de YscF et le changement de sécrétion pour les Yop ¤ cette hypothèse va dans le même sens que des études précédentes sur la fonction de switch de YscP, qui une fois l’assemblage de l’aiguille terminé switch la sécrétion de YscF pour la sécrétion des Yop. ¤ d’après cette hypothèse YscP a une double fonction

33  Modèle du molecular ruler :

34  Modèle du molecular ruler :

35  Modèle du molecular ruler :
N-ter C-ter

36  Modèle du molecular ruler :

37  Modèle du molecular ruler :

38 Characterization of a Type III secretion substrate
Molecular Microbiology (2005) 56(1), 54–67 Characterization of a Type III secretion substrate specificity switch (T3S4) domain in YscP from Yersinia enterocolitica Céline Agrain,Isabelle Callebaut,Laure Journet,Isabel Sorg,Cécile Paroz,Luís Jaime Mota and Guy R. Cornelis (Identification du domaine T3S4 de YscP de Yersinia enterolica)

39 Longueur des aiguilles déterminée par YscP
YscP = molecular ruler (importance région N et C-ter)  YscP responsable du switch de sécrétion ??? Dans ce papier :  par des approches bioinformatiques  et des approches génétiques  identification de la région de YscP responsable de la fonction de switch

40 ¤ Délétions dans yscP – Tests des mutants obtenus pour leur capacité à sécréter les Yop
A. Schematic representations of the yscP in frame deletions mutants together with their ability to secrete Yops.

41 ¤ Délétions dans yscP – Tests des mutants obtenus pour leur capacité à sécréter les Yop
La région de YscP comprise entre 385 et 500 est requise pour la sécrétion des Yop. Pas d’effet sur la sécrétion phénotype intermédiaire (rsd importants) pas de sécrétion (domaine important)

42 ¤ Expérience de Western-blot pour tester la capacité des mutants de délétion à synthétiser YscP
YscP mutantes sont produites et de taille attendue

43 ¤ Impact des délétions sur la sécrétions des Yop (SDS-PAGE coloration au Coomassie)
Délétions avant rsd 381 et après rsd 500 : pas d’effet sur la sécrétion des Yop délétions entre 385 et 500 affectent la sécrétion des Yop NB: le temoin négétif n’est pas complètement négatif pour la sécrétion des YOP

44 Petit Bilan: la région en C-ter comprise entre les rsd 385 et 500 est requise pour la sécrétion des Yop  Ce domaine serait donc responsable de la fonction de switch de spécificité de substrat

45 YscP et FliK ont des fonctions similaires avec seulement 10% d’identité
la fonction de switch de FliK est localisé dans la région C-ter ¤ Ce que ce papier a apporté :  la fonction de switch de YscP est en C-ter ?????: - C-ter de YscP et FliK partagent des similarités ?? - région équivalente dans les protéines des autres injectisomes ou dans les systèmes de type III ??

46 Comment ?  comparaison de C-ter de YscP avec les protéines de la famille Ysc : AscP, PscP, LscP et SctP Alignements multiples déduits d’une analyse PSI-BLAST et ajustés manuellement

47 Résultat :  domaine C-ter conservé (34% d’identité)  Domaine C-ter ( ) : Type III Secretion Substrate Specificity Switch = T3S4

48 ¤ Analyses bioinformatiques :
T3S4 : - structure globulaire - repliement α/β original - signature P-x-L-G  Basé sur sa séquence dans YscP, les limites du T3S4 ont été déterminé :

49 ¤ Expérience de swapping (échange) du T3S4 :
 d’après les analyses bioinfo, le domaine T3S4 de la famille Ysc est très conservé entre les différents membres : repliement et taille du domaine identiques.  Les T3S4 des différentes protéines de la de la famille Ysc peuvent être échangés

50 ¤ Expérience de swapping (échange) du T3S4 :
Remplacement du T3S4 de YscP par : - T3S4 de AscP (Aeromonas salmonicida) - T3S4 de PscP (Pseudomonas aeruginosa) - T3S4 de FliK (S.enterica Thyphi) - T3S4 de FliK (Y.pestis) Comment ? - introduction de 2 sites de restriction au niveau de la région codant le T3S4 de yscP - clonage de la région codant le T3S4 des différentes protéines - introduction des plasmides recombinants dans une souche yscP-

51 ¤ Effets du swapping sur la sécrétion des Yop :
Coomassie stained SDS-PAGE

52 ¤ Effets du swapping sur la sécrétion des Yop :
La sécrétion des Yop est restaurée les T3S4 de AscP et PscP sont capables de jouer le rôle de YscP l’intéraction entre le T3S4 et l’appareil de sécrétion est spécifique Sécrétion des Yop Coomassie stained SDS-PAGE

53 ¤ Contrôle de la longueur des aiguilles :
 Analyse au M.E et mesures de la longueur :  Hybride famille Ysc : switch de spécificité de substrat mais altération de la fonction molecular ruler

54 ¤ Effet des mutations dans le T3S4:
Bioinfo : -la majorité des résidus conservés du T3S4 ont une grande importance dans la structure du domaine - d’autres ne sont pas aussi importants pour la structure  Substitution de ces rsd par une alanine pour voir s’ils ont un effet sur la fonction ?? ¤ Effet des mutations dans le T3S4:

55 ¤ Effet des mutations dans le T3S4:
Ces positions du T3S4 ne sont pas affectées par une substitution par une alanine  Ces rsd ne sont pas impliqués dans la sécrétion

56 ¤ Effet des mutations dans la signature P-x-L-G du T3S4:
 Substitutions des rsd P440 et L442 par une Alanine L442A : phénotype wt pour les 2 fonctions P440A: sécrétion des Yop affectée + contrôle de la longueur des aiguilles moins efficace  seul le rsd P440 de la signature a un effet sur la sécretion et le contrôle de la taille des aiguilles

57 BILAN : T3S4 en C-ter de YscP dans la région T3S4 conservé dans les protéines responsables du contrôle de la longueur dans les différents types d’injectisomes et aussi chez les membres de la famille FliK (flagelle) T3S4 de YscP peut être remplacé par le T3S4 d’un autre membre de la famille Ysc mais pas par le T3S4 d’une autre famille, ni par le T3S4 d’une protéine du flagelle T3S4 a une structure globulaire Ce domaine a une signature P-x-L-G impliquée dans la fonction

58 Conclusions :  YscP agit comme un « molecular ruler » (N et C-ter)  C-ter est requis pour le contrôle de la taille des aiguilles et pour la sécrétion des Yop YscP exerce la fonction de switch de spécificité de substrat (T3S4) : sécrétion de YscF arrêt de sécrétion de YscF et sécrétion des Yop T3S4 est un domaine globulaire dont la structure est conservée dans les orthologues des systèmes injectisomes et flagelles l’interaction entre le T3S4 et l’appareil de sécrétion est spécifique les phénotypes perte de contrôle de la longueur et pas de sécrétion de Yop peuvent être dissociés

59 J Bacteriol. 2008 Jun;190(12):4252-62. Epub 2008 Apr 18
YscP and YscU switch the substrate specificity of the Yersinia type III secretion system by regulating export of the inner rod protein YscI. Wood SE, Jin J, Lloyd SA. Department of Pediatrics, Center for Vaccine Development, University of Maryland at Baltimore, 685 W. Baltimore St., Baltimore, MD 21201, USA. Pathogenic yersiniae utilize a type III secretion system to inject antihost factors, called Yops, directly into the cytosol of eukaryotic cells. The Yops are injected via a needle-like structure, comprising the YscF protein, on the bacterial surface. While the needle is being assembled, Yops cannot be secreted. YscP and YscU switch the substrate specificity of the secretion system to enable Yop export once the needle attains its proper length. Here, we demonstrate that the inner rod protein YscI plays a critical role in substrate specificity switching. We show that YscI is secreted by the type III secretion system and that YscI secretion by a yscP mutant is abnormally elevated. Furthermore, we show that mutations in the cytoplasmic domain of YscU reduce YscI secretion by the yscP null strain. We also demonstrate that mutants expressing one of three forms of YscI (those with mutations Q84A, L87A, and L96A) secrete substantial amounts of Yops yet exhibit severe defects in needle formation. In the absence of YscP, mutants with the same changes in YscI assemble needles but are unable to secrete Yops. Together, these results suggest that the formation of the inner rod, not the needle, is critical for substrate specificity switching and that YscP and YscU exert their effects on substrate export by controlling the secretion of YscI.

60 J Bacteriol. 2008 Sep;190(18):6204-16. Epub 2008 Jul 18
Impassable YscP substrates and their impact on the Yersinia enterocolitica type III secretion pathway. Riordan KE, Sorg JA, Berube BJ, Schneewind O. Department of Microbiology, University of Chicago, Chicago, IL 60637, USA. Yersinia type III machines secrete protein substrates across the bacterial envelope and, following assembly of their secretion needles, transport effector Yops into host cells. According to their destination during type III secretion, early, middle, and late secretion substrates can be distinguished; however, the signals and mechanisms whereby these proteins are recognized and transported by the secretion machine are not understood. Here, we examine several hybrids between secretion substrates and the impassable reporter protein glutathione S-transferase (GST). YscP-GST and YopR-GST blocked type III secretion; however, YscF-, YopD-, YopN-, and LcrV-GST did not. Unlike YopR-GST, which can block type III machines only during their assembly, expression of YscP-GST led to an immediate and complete block of all secretion. The secretion signal of YscP was mapped to its first 10 codons or amino acids; however, YscP(Delta 2-15)-GST, lacking this secretion signal, imposed a partial blockade. YscP-GST copurified with the type III ATPase complex (YscN, YscL, and YscQ) and with YscO, suggesting that the association of specific machine components with the impassable substrate may cause the block in type III secretion.