Thèse présentée pour obtenir le grade de

Présentation au sujet: "Thèse présentée pour obtenir le grade de"— Transcription de la présentation:

1 XRCC1, un élément clef de la réparation des lésions de l’ADN couplée à la réplication
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Louis Pasteur – Strasbourg I Nicolas Lévy 22 novembre 2007 Thèse réalisée au sein du département Intégrité Du Génome de l’ UMR 7175, ESBS, sous la direction de Josiane et Gilbert de Murcia Dessin de N.Bouvier pour G.Almouzni

2 Discussion et perspectives : Introduction :
Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses Introduction : Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

3 Désamination spontanée, Réactions spontannées
Les différents types de lésions de l’ADN Modification de base: Désamination spontanée, Alkylation, Oxydation Cassure simple-brin (SSB) Site abasique double-brin (DSB) Dimère de thymine G T Nucléotides mésappariés Réactions spontannées Agents alkylants Radicaux oxygénés Rayons X Radiomimétiques Rayons UV Erreurs de la réplication BER SSBR DSBR: NHEJ HR NER MMR L’ADN des cellules eucaryotes, support de leur info genetique est soumis aux attaques constantes d’agents génotoxiques d’origine environnementale, ou issu du métabolisme cellulaire. Ils induisent une grande diversité de lésions qui sont prises en charge par des mécanismes de réparation spécifiques. Nous aborderons ici plus en détails les cassures simple-brin (SSB) qui sont des interruption du squelette sucre-phosphate d’un des deux brin de la molécule d’ADN et les cassures double-brin (DSB) de l’ADN qui sont des interruption simultanée dans le squelette des deux brin de la double hélice d’ADN. Adapté de D.M.Wilson III et al., Encyclopedia of Respiratory Medicine, Ed. Elsevier, 2005

4 Discussion et perspectives :
Introduction : Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

5 Réparation des cassures simple-brin de l’ADN (SSBR)
• Reconnaissance de la base endommagée APE1 XRCC1 • Reconnaissance de la cassure simple-brin (SSB) P OH PARP-1 5' P OH 5' P OH g-Rays, ROS... • Recrutement de XRCC1 assemblage du complexe de réparation Lig3 XRCC1 • Traitement des extrémités de la lésion Lig3 P OH PNK XRCC1 • Remplissage de la brèche PNK Lig3 PARP-2 Polß XRCC1 PARP-1 FEN1 Les cassures simple-brin sont les lésions de l’ADN les plus fréquentes. Elles peuvent survenir directement par l’action de rayonnement ionisants ou de radicaux libres oxygénés mais aussi indirectement au cours de la réparation des bases endommagées lors de l’incision de l’ADN par une endonucléase au niveau d’un site abasique. La cassure simple-brin est reconnue par la poly(ADP-ribose)polymerase 1 PARP1 qui en réponse à ces lésions, synthétise un polymere d’ADP-ribose permettant le recrutement du facteur de réparation XRCC1 et de son partenaire ADN ligase III. XRCC1 va ensuite recruter et stimuler différentes protéines responsables des etapes suivantes de traitement des extrémités de la lésion, de synthèse d’ADN par l’ADN polB, puis de ligation finale des extrémités de la cassure. Adapté de Whitehouse et al. (2001) Cell 104, • Ligation des extrémités de la lésion Polß XRCC1 Lig3 PARP-1 PARP-2

6 LA famille PARP PARP1, qui est a l’initiation du mécanisme de SSBR, est le membre fondateur d’une famille de 17 membres ayant tous en commun un même motif, le domaine PARP. PARP-1 partage avec PARP-2, qui est elle-aussi impliquée dans la réparation des cassures simple-brin, la particularité d’etre dépendante de l’ADN. Schreiber et al., Nature Reviews, 2006

7 La réaction de poly(ADP-ribosyl)ation
Schreiber et al., Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2006 C’est-à-dire qu’en présence de cassures simple-brin dans l’ADN, PARP-1 fixée au site du dommage (CE QUE L’ON PEUT OBSERVER ICI EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE) va s’activer, et métaboliser le NAD pour synthétiser un long polymere branché d’ADP-ribose: le poly(ADP-ribose) ou PAR (MICROSCOPIE). Cette réaction est une modification posttraductionnelle catalysée sur des protéines nucléaires acceptrices, qui peuvent etre PARP1 elle-même (on parle alors d’automodification) soit d’autre prot (hétéromodif). Cette réaction est par aileurs reversible puisque la poly(ADP-ribose) glycohydrolase PARG dégrade rapidement le PAR. PARP-1 ADN Poly(ADP-ribose) (PAR)

8 Les rôles de la poly(ADP-ribosyl)ation
Schreiber et al., Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2006 PARylation des histones Cette modification posttraductionnelle a deux fonctions principales : Recruter des facteurs de réparation grâce à l’affinité de ces derniers pour le PAR Favoriser l’acces des protéines de réparation au site de la lésion par l’hétéromodification des histones, ce qui entraîne une relaxation de la structure de la chromatine observale en microscopie electronique.

9 Recrutement de XRCC1 au niveau des lésions de l’ADN
X-ray Repair Cross Complementing group 1, XRCC1 Protéine sans activité enzymatique : rôle de plateforme d’interaction et d’organisation Deux domaines homologues à l’extrémité C-terminale de BRCA1 (BRCT) Recrutée en quelques secondes au niveau des coupures de l’ADN sur le PAR synthétisé par PARP-1 Anti-PAR Anti-XRCC DAPI + merge Recrutement de XRCC1 au niveau des lésions de l’ADN Une autre protéine indispensable à la réparation des cassures simple-brin de l’ADN est XRCC1. Cette protéine n’a pas d’activité enzymatique connue, mais joue un rôle de plateforme d’organisation du SSBR grace à la mutlitude des interactions protéiques qu’elle assure. Elle possede deux BRCT qui permettent les interactions avec PARP1/2 et Lig3. Elle possede par ailleurs une forte affinité pour la PAR lui permettant d’etre recruté en quelques secondes au site des lésions de l’ADN sur le polymère synthétise par PARP-1, recrutement observable de manière tres evidente en immunofluorescence, au niveau de lésions induites dans l’ADN de cellules par microirradiation laser.

10 Discussion et perspectives :
Introduction : Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

11 Réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBR)
Hautement toxiques pour la cellule : pertes de fragments de chromosomes, translocations... Directes (rayonnements ionisants, drogues radiomimétiques) Indirectes (réplication d’un ADN endommagé) Deux voies de réparation des DSB: Recombinaison homologue (RH) : phases S tardive et G2 du cycle cellulaire Recombinaison non homologue (NHEJ) : tout au long du cycle cellulaire Rothkam et al., Mol. Cel. Biol., 2003 NHEJ HR Un autre type de cassure de l’ADN, les cassures double-brin sont les lésions les plus toxiques pour la cellule car elle peuvent entraîner... Elle peuvent survenir directement suite à une exposition à des rayonnements ionisants ou des drogues radiomimétiques, ou Indirectement : lors de la réplication d’un ADN endommagé, la collision d’une fourche de réplication avec un SSB non réparer peut bloquer l’avancement de la réplication et entraîner le dissociation de la fourche de réplication, résultant en une cassure double-brin. Deux méca de réparation : RH et NHEJ que nous allons détailler ici.

12 Réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBR) par NHEJ
Ku70/Ku80 • Reconnaissance du DSB par Ku70/Ku80, sous-unités de DNA-PK DNA-PKcs DNA-PK • Fixation de DNA-PKcs, assemblage de l’holoenzyme DNA-PK • Alignement des deux extrémités de la lésion Premiere etape = reconnnaissance de la lésion par les sous-unité Ku70 et Ku80 de DNA-PK. La sous unité catalytique DNA-PKcs est ensuite recrutée, formant alors l’holoenzye DNA-PK. LigIV/XRCC4/XLF • Ligation finale des deux extrémités de la cassure double-brin Helleday et al., DNA Repair, 2007

13 Discussion et perspectives :
Introduction : Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses Afin de pouvoir garantir le maintien de l’intégrité du génôme des cellules eucaryote, ces mécanismes de réparation de l’ADN doivent être coordonés avec les autres processus cellulaires, comme la réplication de l’ADN par exemple, dans les cellules en prolifération.

14 Réplication de l’ADN Duplication fidèle du matériel génétique de la cellule avant sa division Deux étapes principales : initiation et élongation Initiation : synthèse d’un oligonucléotide ARN/ADN servant d’amorce aux ADN polymérases réplicatives Elongation : recrutement de l’anneau de processivité PCNA et des ADN polymérase réplicatives hautement fidèles et processives Elongation Brin discontinu Brin continu Initiation Initiation = assemblage du complexe de préinitiation formé de nombreuses protéines, au niveau des origines de réplication, puis synthèse des amorces ARN/ADN par le complexe ADNpola-primase. Elongation = recrutement de l’anneau de processivité PCNA avec les polymérases réplicatives dotés d’une grande fidélité et processivité, permettant la réplication de longues portions d’ADN.

15 Le complexe ADN polymérase a-primase
Complexe tetramérique chargé de la synthèse des amorces d’ARN/ADN nécessaires à l’initiation de la réplication et à la synthèse des fragments d’Okazaki L’ADN primase p48-p58 synthétise la portion ARN des amorces L’ADN polymérase a synthétise la portion ADN des amorces L’ADN primase agit comme frein moléculaire au cours de la réplication de l’ADN (Jong-Bong Lee et al., Nature 439, ) p58 est la sous-unité régulatrice de l’ADN primase eucaryote Arezi et al., TIBS, 2000 Au cours de l’etape d’initiation, le complexe ADNpola-primase a un role primordial. Ce complexe heterotetramerique est chargé de la synthèse de l’amorce à l’initiation de la synthèse du brin continue, ainsi que de la synthèse des amorces nécéssaire à la synthèse de chaque fragment d’okazaki du brin discontinu.

16 Discussion et perspectives :
Introduction : Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses Comme je vous l’ai dit précédement, la coordination entre réparation et réplication est primordiale au maintien de l’intégrité du génome. Cette coordination permet notament d ’eviter lors de la réplication d’ADN endommagés, des accidents pouvant générer des cassures double-brin.

17 Un rôle pour XRCC1 dans le coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
Les cellules EM9 déficientes en XRCC1 présentent 12x plus d’échanges de chromatides sœurs (SCE) que les cellules sauvages (Dillehay et al., Mutat. Res., 1983) La mutation du domaine BRCT1 entraîne une diminution de la survie des cellules après traitement au MMS (Taylor et al., Mol. Cell. Biol., 2002) La mutation du domaine BRCT1 entraîne un défaut de redémarrage de la synthèse d’ADN après traitement au MMS (Kubota et al., Nucl. Acids Res., 2003) XRCC1 interagit avec l’anneau de processivité PCNA et colocalise avec cette protéine au niveau des foyers de réplication (Fan et al., Nucl. Acids Res., 2004) Les cellules traitées par ARN interférence dirigé contre XRCC1 s’accumulent en phase S 24h après traitement au MMS (Brem et al., Nucl. Acids Res., 2005)

18 Discussion et perspectives :
Introduction : Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses Afin d’examiner ce nouveau role potentiel d’XRCC1, nous avons cherché a indentifier des nouveaux partenaires de la protéine

19 Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
Surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 en fusion avec la GST dans E. coli Immobilisation sur colonne de GSH-sepharose Incubation avec extraits protéiques des cellules HeLa Elution du GST-BRCT1 et des partenaires co-purifiés Séparation des protéines par SDS-PAGE et analyse par spectrométrie de masse GST GST- BRCT1 PARP-1 PCNA GST-BRCT1 Dimère de GST DNA-PKcs Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interet : p58 et DNA-PKcs. L’etudes des interactions entre XRCC1 et ces deux protéines fait l’objet des deux parties suivantes de ma présentation. p58

20 Discussion et perspectives :
Introduction : Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

21 XRCC1 et p58 interagissent in vitro
b c d e GST-XRCC1 1-170 GST a b c d e WB Le domaine BRCT1 de XRCC1 est suffisant pour l’interaction avec p58 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase après traitement à l’hydroxyurée Nous avons dans un premier temps cherché à confirmer l’interaction entre XRCC1 et p58 par IP.... Nous avons ensuite cartographié le domaine de XRCC1 mis en jeu dans cette interaction.... Le domaine BRCT1 est suffisant, ce qui n’est pas etonnant vu que c lui qui avait servi a isoler les partenaires identifié en spectrométrie de masse, et on note aussi une faible interaction avec le fragment N-ter de XRCC1.

22 XRCC1 interagit avec la moitié N-terminale de p58
Far western blot Anti-XRCC1 Amido black Nous avons ensuite examiné l’interaction directe entre les deux protéines par far western blot. Pour cela nous avons séparé sur gel d’acrylamide les deux sous unités de l’ADN primase p48 p58. Apres incubation avec la protéine XRCC1 recombinante purifiée, on constate seule p58 interagit avec XRCC1. Nous avons de plus cloné et purifié les moitiés N et C terminale de p58, et nous montrons que c’est la moitié Nter de p58 qui est impliquée dans cette interaction. XRCC1 p58 N C G NLS

23 XRCC1 et p58 interagissent in vivo
DAPI+Merge XRCC p58 -HU HU XRCC1 et p58 colocalisent dans les foyers de réplication des cellules traitées par hydroxyurée Nous avons ensuite voulu mettre en évidence l’interaction in vivo entre ces deux protéines. Analyse en IF de la localisation cellulire des deux prot, avant ou apres traitement HU (bloque l’avancement des fourches de réplication).

24 Le poly(ADP-ribose) et l’ADN sont en compétition pour un même site de fixation sur p58
p58 lie le PAR par sa moitié N-ter Test de mobilité électrophorétique: Le PAR inhibe la liaison de p58 à l’ADN substrat Il est bien connu que XRCC1 est recruté en quelques secondes aux sites de lésions de l’ADN grace à sa forte affinité pour le PAR synthétisé en réponse aux dommages par PARP-1. L’obesrvation que XRCC1 interagit avec p58 par son domaine BRCT1, celui là meme qui lie le PAR et est modifié par PARP-1 en réponse aux dommages nous a ammené à examiner si le PAR pouvait avoir une influence sur p58 et l’activité primase. Nous avons tout d’abord cherché à savoir si l’ADN primase a une affinité pour le PAR. Le PAR et l’ADN sont en compétition pour un même site de fixation sur p58

25 La fixation de PAR par p58 inhibe l’activité primase de p48-p58 in vitro
Influence du PAR sur l’activité primase La liaison du PAR à p58 inhibe fortement l’activité primase du complexe p48-p58 La compétition entre PAR et ADN pour un meme site de liaison sur p58 nous a ammené à tester un impact potentiel de cette interaction PAR/p58 sur l’activité primase. Nous avons donc analysé l’activité primase de p48-58 en suivant l’incorporation d’ ATP radiomarqué sur un subtrat Oligo(dT)20. pour de faible concentration en PAR, l’activité primase est normale, mais quand on atteint un rapport PAR/ADN de 1, l’activité primase se trouve tres fortement inhibée.

26 Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent des niveaux élevés de PAR
DAPI GFP-BRCT Anti-PAR Colocalisation +H2O Contrôle Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent une forte automodification de PARP-1 et une forte hétéromodification de XRCC1 au niveau de son domaine BRCT1 Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent des niveaux significatifs de PAR nucléaire en absence de traitement, et des niveaux très élevés de PAR après endommagement de l’ADN XRCC1 interagissant avec PARP par son BRCT1, nous avons voulu examiner un possible impact de la surexpression de ce domaine dans les cellules HeLa sur l’activité PARP => IF anti PAR +/- H2O2 Nous avons ensuite vérifié par immunoblot que les forts niveaux de PAR observés en réponse au traitement H2O2 dans les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 se traduit par une forte automodification de PARP-1 et par une forte hétéromodification du BRCT1 surexprimé, ainsi que de la forme endogène de XRCC1. confirmant la colocalisation entre GFP BRCT1 et PAR observée par IF.

27 XRCC1 est nécessaire à la progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé
2n 4n n 4n La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 perturbe fortement la progression des cellules à travers le cycle cellulaire, après traitement au MNU Nous avons vu que XRCC1 interagit avec p58 via son domaine BRCT1. Nous avons vu par ailleurs que ce BRCT1 est fortement hétéromodifiée parPARP-1 en réponse aux dommages de l’ADN dans les cellules surexprimant cette protion de XRCC1. Nous avons enfin montré que l’activité primase de p48-58 est fortement inhibée par le PAR. Nous nous sommes donc demandé si cette interaction entre le BRCT1 modifié de XRCC1 et p58 pouvait avoir un impact sur la progression a travers le cycle cellulaire des cellules surexprimant le BRCT1. Pour cela, différents domaines de XRCC1 ont été surexprimés en fuision avec la GST dans des cellules HeLa…

28 La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 inhibe la progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 entraîne une accumulation des cellules en début de phase S : la réplication est inhibée, ralentie

29 Le modèle Xenopus laevis
Allotétraploïde 36 chromosomes 20-22°c température optimale de croissance ♀ 11cm / ♂ 6cm œufs 1,2-1,3 mm Ø 1000 à 6000 œufs/ponte temps de génération >2 ans Microinjection, Extraits d’œufs , Réplication in vitro Pour analyser au niveau moléculaire cette inhibition de la réplication des ADN endommagés par les domaine BRCT1 de XRCC1, nous nous sommes tournés vers le système d’etude de la réplication dans les extraits d’œufs de xénope. J’ai pu réaliser mes expérience à l’IGH de montpellier dans l’equipe de D.Maiorano ici présent.

30 Réplication de l’ADN dans les extraits d’œufs de xénope
Extraits d’oeufs de xénope ADN matrice Formation d’une Membrane nucléaire Cycle unique et complet de réplication de l’ADN Analyse des cinétiques de réplication Analyse des protéines (WB, IF) Analyse de la taille des ADN synthétisés Le système de réplication in vitro dans les extraits d’œufs de xenope repose sur la capacité qu’ont de tels extraits, mis en présence d’un ADN matrice (typiqueemnt un ADN de sperme de xenope), a reconstituer une pseudo membrane nucléaire autour de l’ADN puis à catalyser un cycle unique et complet de réplication du matériel génétique. Système acellulaire : Immunodeplétion (anticorps anti-XRCC1) Utilisation d’inhibiteurs PARP/PARG Addition de protéines recombinantes (BRCT1 / BRCT2) Traitement de la chromatine par des agents génotoxiques

31 XRCC1 est une protéine fortement conservée au cours de l’évolution
~ 80% d’homologie de séquence entre la protéine humain et celle de xénope > 90% d’identité de séquence au niveau du domaine BRCT1 @XRCC1 Pc souris A Xenopus egg extracts HeLa cells @PARP1 Pc souris EGT69 Xenopus egg extracts HeLa cells

32 X.l. XRCC1 BRCT1 ralentit la réplication des ADN endommagés
Chromatine non traitée Chromatine traitée MMS Tailles des ADN répliqués Analyse de la taille des ADN répliqués sur gel alcalin Analyse des cinétiques de réplication de l’ADN Afin d’etudier le rôle du BRCT1 de XRCC1 dans le système xenope, le domaine BRCT1 de X.l XRCC1 a été produit en fusion avec la GST et ajouté aux extraits d’œufs de xenope. L’etude de la cinétique de réplication des ADN de sperme de xenope nous montre que l’addition de BRCT1 recombinant ralentit la réplication des ADN endommagés par traitement à l’agent alkylant MMS. De la meme manière, l’analyse de la taille des ADN répliqués nous montre que la réplication des ADN endommagés est fortement inhibée en présence de BRCT1. L’addition de GST-BRCT1 recombinant dans les extraits d’œufs de xénope freine la réplication des ADN endommagés

33 X.l. XRCC1 BRCT1 bloque l’initiation de la réplication des ADN endommagés
Pour déterminer l’étape précise de la réplication qui est inhibée par le domaine BRCT1 en réponse aux dommages dans l’ADN, nous avons analysé les protéines associées à la chromatine dans différentes conditions. Lors de la réplication d’un ADN traité au MMS, en présence du domaine BRCT1 de XRCC1, on constate une accumulation de MCM2, protéine associée à la chromatine lors de l’initiation de la réplication, ainsi qu’une forte diminution l’association de l’anneau de processivité PCNA à la chromatine, traduisant une inhibition de l’initiationde la réplication des ADN endommagés par les domaine BRCT1 de XRCC1. Accumulation de complexes de pré-initiation Défaut d’association de PCNA sur la chromatine  Inhibition de l’initiation de la réplication

34 L’inhibition de la réplication des ADN endommagés par XRCC1 BRCT1 est dépendant de sa PARylation
Analyse des cinétiques de réplication de la chromatine endommagée au MMS +GST-BRCT1 + GST-BRCT1 + inhibiteur PARP KU + GST L’inhibition de la réplication des ADN endommagés par le domaine BRCT1 de XRCC1 dépend de sa modification par PARP-1 Nous avons vu que dans les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1, l’interaction entre le BRCT1 hétéromodifié et p58 inhibe la réplication des ADN endommagés. Nous avons donc cherché à savoir si l’activité PARP est importante pour l’inhibition de l’initiation de la réplication des ADN endommagés dans les extraits d’œufs de xenope. Nous avons donc analysé la cinétique de réplication d’un ADN traité par MMS en présence du domaine BRCT1 de XRCC1 et d’un inhibiteur de l’activité PARP. Nous constattons que cet inhibiteur permet de restaurer partiellement l’inhibition de la réplication par le domaine BRCT1 que que cette inhibition dépend donc bien de l’hétéromodification de ce domaine.

35 Modèle : XRCC1 interagit avec p58 pour freiner la réplication des ADN endommagés afin de préserver l’intégrité du génome Nous pouvons donc synthétiser ces résultats sous forme d’un modèle. Au cours de la réplication de l’ADN, en présence de SSB, PARP-1 et XRCC1 hétéromodifié sur son BRCT1 permettraient : D’inhiber l’initiation de la réplication au niveau des origines de réplication par l’inhibition de l’activité primase résultant de l’interaction BRCT1-PAR-p58 D’inhiber l’avancement des fourches de réplication toujours grace à l’interaction entre BRCT1 modifié et la sous unité p58 de l’ADN primase nécéssaire à la synthèse des fragments d’okazaki, ou empechant le decouplage brin continu/brin discontinu. Cet arret de la réplication donne du temps à la cellule pour reparer ses SSB et evite ainsi une collision directe entre fourche et SSB , ce qui pourrait entrainer DSB.

36 Discussion et perspectives :
Introduction : Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

37 Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
Surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 en fusion avec la GST dans E. coli Immobilisation sur colonne de GSH-sepharose Incubation avec extraits protéiques des cellules HeLa Elution du GST-BRCT1 et des partenaires co-purifiés Séparation des protéines par SDS-PAGE et analyse par spectrométrie de masse GST GST- BRCT1 PARP-1 PCNA GST-BRCT1 Dimère de GST DNA-PKcs p58

38 DNA-PK interagit avec le domaine BRCT1 de XRCC1
GST-XRCC1 1-170 GST a b c d e DNA-PK interagit avec le domaine BRCT1 de XRCC1 Far western blot Anti-XRCC1 XRCC1 interagit avec les 3 sous-unités de DNA-PK Confirmer l’interaction par IP avec des anticorps dirigés contre les trois sous untiés de DNA-PK. Far western blot pour montrer interaction directe entre XRCC1 et ces 3 sous-unites. Cartographie du site d’interaction : BRCT1 domaine minimal.

39 XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK sur son domaine BRCT1 en réponse aux rayons ionisants
GST-XRCC1 1-170 GST a b c d e Le domaine BRCT1 de XRCC1 est phosphorylé in vitro par DNA-PK Le domaine BRCT1 de XRCC1 est phosphorylé in vivo par DNA-PK en réponse aux rayonnements ionisants Afin de déterminer si l’interaction entre XRCC1 et DNA-PK est fonctionnelle, divers essais kinase ont été réalisés. La surexpression des différents domaines de XRCC1 dans HeLa suivi par capture GST et essai kinase in vitro montre que c’est le BRCT1 qu’est phosphorylé Radiomarquage métabolique à l’ATP radiomarqué, IP anti-XRCC1 => phosphorylation en réponse IR IDEM sur BRCT1 surexprimé

40 XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK au niveau de sa sérine 371
Un seul motif potentiel de phosphorylation par DNA-PK de type SQ au sein du domaine BRCT1 de XRCC1 : SQ 371/372 La sérine 371 de XRCC1 constitue le site de phosphorylation par DNA-PK L’etude de la séquence de XRCC1 nous a montré qu’il n’existait qu’un site potentiel de phosphorylation pour DNA-PK de type SQ au sein du BRCT1 : Ser 371 Afin de vérifier que cette serine 371 est bien le site de phosphorylation par DNA-PK, nous avons généré un mutant non phosphorylable par mutation de la sérine 371 en leucine,puis nous avons exprimé les formes sauvages et mutants de XRCC1 dan HeLa. Après IP, un essai kinase a été réalise et a montré que, alors que la forme sauvage de XRCC1 est bien phosphorylée, le mutant S371L ne l’est plus. Ser 371 est bien la cible de DNA-PK sur XRCC1

41 XRCC1 dimérise via son domaine BRCT1 et la phosphorylation de la sérine 371 entraîne la dissociation du dimère XRCC1 a b c d e GST-XRCC1 1-170 XRCC1 Le domaine BRCT1 de XRCC1 est une interface de dimérisation La phosphorylation de la sérine 371 entraîne la dissociation du dimère XRCC1 BRCT1 XRCC1 BRCT1 XRCC1 P Les domaines BRCT sont connus pour leur capacité à dimériser et sont souvent retrouvés associes sous formes de tandems (BRCA1, 53BP1). Nous avons voulu examiner la possibilité que XRCC1 dimérise via ses domaines BRCT. Les différents domaines de XRCC1 ont été exprimés en fusion avec la GST dans HeLa, puis des extraits protéiques de ces cellules ont été incubés avec des extraits de cellules HeLa exprimant la forme pleine longueur de XRCC1 en fusion avec Flag. Apres GST-pull down, la présence de FLAG XRCC1 co-purifiée avec les différents domaines taggés GST est analysée par western blot => Flag XRCC1 est associé au mutants de délétion contennat le domaine BRCT1. DNA-PK

42 Le dimère XRCC1 stimule l’activité kinase de DNA-PK in vitro
GST S15 P P53 XRCC1 stimule fortement l’activité kinase de DNA-PK XRCC1 etant connu pour stimuler l’activité de plusieurs de ses partenaires au cours des voies de BER/SSBR, nous avons voulu déterminer si il a la capacité de stimuler l’activité kinase de DNA-PK. Pour cela nous avons élaboré un test d’activité DNA-PK utilisant un subtrat de synthèse composé d’un peptide correspondant à une séquence de p53 contenant la Ser15, substrat connu de DNA-PK, en fusion avec la GST. C’est la forme dimère de XRCC1 qui possède cette capacité à stimuler DNA-PK

43 Le mutant S371L de XRCC1 entraîne la persistance de cassures double-brin de l’ADN
(Déficientes en XRCC1) XRCC1 wt EM9 XRCC1 S371L NT 1Gy/1H Immunofluorescence: anti-gH2AX Foyers gH2AX = sites de cassures double-brin de l’ADN DNA-PK étant un acteur majeur de la réparation des DSB par NHEJ, nous avons examiné le role physiologique de l’interaction XRCC1/DNA-PK dans le réparation des DSB. Pour cela, nous avons utilisé come modèle les cellules EM9 déficientes en XRCC1, que nous avon transfécté avec la forme sauvage ou mutante S371L de XRCC1. Apres irradiation au rayon X, nous avons suivi la cinétique de réparation des DSB dans chaque lignées en observant les foyers yH2AX qui sont des marqueurs de DSB. La forme sauvage de XRCC1 a été capable de restaurer de manière efficace le défaut de réparation observé dans la lignée EM9, alors que l’expressions la forme mutante S371L a entrainé une persistance des cassures double-brin. Le mutant non phosphorylable S371L de XRCC1 entraîne une persistance des DBS alors qu’il est capable de stimuler l’activité kinase de DNA-PK Le dimère XRCC1 est capable de stimuler l’activité kinase de DNA-PK, mais sa dissociation est importante pour la suite du mécanisme de réparation des DSB

44 Modèle : XRCC1 agit comme commutateur entre les voies
de SSBR et DSBR XRCC1 dimere en phase G1 participe au SSBR classique. EN phase S, en cas de collision entre fourche et SSB non réparé, et de transfo de ce SSB en DSB, XRCC1 agirait comme commutateur entre SSBR et DSBR en stimulant l’activité de DNA-PK, et passerait sous forme monomere apres phosphorylation de sa ser371 permettant la suite des etapes du NHEJ => Prise en charge immédiate et efficace des DSB générés au cours de la réplication maintient de l’intégrité du genome.

45 Discussion et perspectives :
Introduction : Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

46 (Ruscetti et al., J. Biol. Chem., 1998)
XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 du complexe ADN polymérase a-primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK et stimule l’activité de cette kinase pour favoriser la réparation des DSB générés lors de la réplication de l’ADN PARP-1 interagit avec l’ADN polymérase a et inhibe son activité en l’hétéromodifiant (Eki et al., FEBS Letters , 1994; Simbulan-Rosenthal et al., Biochemistry, 1996; Dantzer et al., Nucl. Acids Res., 1998) PARP-1 interagit avec DNA-PK et stimule son activité kinase en l’hétéromodifiant (Ruscetti et al., J. Biol. Chem., 1998) XRCC1 et PARP-1 forment un couple étroitement lié et agissent de façon synergique pour inhiber la réplication des ADN endommagés et pour organiser la transition entre SSBR et DSBR

47 XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

48 Discussion et perspectives :
Introduction : Les différents types de lésions de l’ADN La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1 La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ? Résultats : Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1 XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN Discussion et perspectives : XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses Ces rôles centraux qu’ont XRCC1 et PARP-1 dans la gestion des lésions de l’ADN au cours de la phase S des cellules en prolifération fait de ces deux protéines des cibles de choix pour les thérapies anticancéreuses.

49 XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
Chimiothérapies, radiothérapies : endommagement de l’ADN de cellules tumorales pour provoquer leur mort. Limites : effets secondaires sur les cellules saines de l’organisme, résistance des tumeurs Inhibition des voies de réparation de l’ADN : potentialisation des traitements anticancéreux Inhibiteurs PARP : potentialisation des traitements par irradiation effet important sur les tumeurs liées à BRCA1/2 Bryant et al., Nature, 2005 G. Noël et al., Mol. Cancer Ther., 2006

50 XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
Inhibition des fonctions du domaine BRCT1 de XRCC1 : perturbation de la prise en charges de lésions au cours de la réplication ainsi que du NHEJ Aptamère (court oligonucléotide à structure tridimensionnelle complexe) : Forte affinité pour une cible protéique spécifique Inhibition des fonctions de la cible liée Peptide inhibiteur, se liant en dominant négatif au domaine BRCT1 de XRCC1 et empêchant les interactions protéiques normalement assurées par ce domaine Accumulation importante de lésions dans l’ADN Ciblage spécifique des cellules tumorales en prolifération

51 Un grand merci : http://parplink.u-strasbg.fr
DEPARTEMENT “INTEGRITE DU GENOME” DE l’UMR 7175 ECOLE SUPERIEURE DE BIOTECHNOLOGIE DE STRASBOURG UNIVERSITE LOUIS PASTEUR LRC-CEA n° 39 boulevard Sébastien Brant, BP 10413 F Illkirch Cedex, France Laboratoire de recherche associé n° 39V Un grand merci : A tout le département « Intégrité Du Génome » de l’ESBS : A Josiane Ménissier de Murcia, Directrice de thèse Au Dr. Marcel Méchali et à tout le laboratoire « Surveillance et Stabilité du Génome » de l’Institut de Génétique Humaine de Montpellier Au jury : Directeur de thèse : Dr. Gilbert de Murcia Rapporteur interne : Pr. Philippe Carbon Rapporteur externe : Dr. Janet Hall Rapporteur externe : Dr. Pablo Radicella Examinateur : Dr. Domenico Maiorano Invitée : Dr. Anne Bresson

52

53

54 Activité spécifique : Sa = (CPMi x Fd)/(CdATPxV) (cpm/pmol dATP)
Quantité de dATP incorporée : ndATP = (CPM x Fd)/Sa (pmol) Masse des nucléotides incorporés : m = ndATP x 4 x 0, (ngr) Pourcentage d’ADN répliqué = m / mchromatin

55 Inhibition de la réplication indépendante des checkpoints

56 Conclusions Perspectives
La réplication de l’ADN est inhibée par l’interaction entre le domaine BRCT1 (PAR)ylé de XRCC1 et la sous-unité p58 de l’ADN primase, en réponse au stress génotoxique, afin de maintenir l’intégrité du génome (évite les collisions entre les fourches de réplication et les SSB non réparés, susceptibles de générer des DSB hautement toxiques) Arrêt de la réplication par inhibition de l’ ADN primase par le ppGpp en response stress nutritionel (Wang et al. Cell 128, ) Stabilisation de la machinerie réplicative sur un ADN endommagé grâce à l’ATP généré lors de la dégradation du PAR (Maruta et al. Biol. Pharm. Bull. 30, ) Perspectives Etude dans un modèle déficient pour XRCC1 (cellules EM9, extraits d’oeufs de xénope déplétés pour XRCC1…) Etude de la réplication sur un substrat synthétique avec des lésions localisées