1 Titre (Bio-)Analytique des Substances Secondaires et leurs Métabolites dans des Plantes Médicinales par Électrophorèse Capillaires (dans les Contrôles.

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1 1 Titre (Bio-)Analytique des Substances Secondaires et leurs Métabolites dans des Plantes Médicinales par Électrophorèse Capillaires (dans les Contrôles Pharmaceutiques et Bioanalytiques) Thèse écrit en 2001 par M. Ingmar Glöckl à la faculté de Chimie Pharmaceutique à la Wilhelms-Université de Münster en Allemagne

2 2 Contenus  Exemples d’Applications  Critères pour la validation d’une méthode analytique  Raisin d’ours  Arbutin et son métabolisme chez l’homme  Biodisponibilité  Electrophorèse capillaire  Electrophorèse capillaire de l’Arbutin dans l’urine humain  Conclusion

3 3 Exemples d’Applications des Méthodes Analytiques des Substances Secondaires dans les Plantes Médicinales

4 4 Glucosides Ginséniques

5 5 Des Alcaloïdes d’Opium

6 6 Des Substances Caractéristiques des Artichauts

7 7 Raisins d’Ours

8 8 Validation methods for direct determination of hydroquinone glucuronide and sulfate in human urine after oral intake of bearberry leaf extract by capillary zone electrophoresis

9 9 Critères pour la validation d’une méthode analytique Paramètres pour la validation :  Spécificité-Sélectivité  Linéarité  Intervalle de mesure  Exactitude  Fidélité (répétitivité, fidélité intermédiaire)  Seuil de détection (Limit of Detection : LOD)  Seuil de quantification (Limit of Quantification : LOQ)

10 10 Raisin d’ours = Arctostaphylos uva-ursi L.

11 11 Principaux constituants dans les Uvae Ursi Folium  Dérivés hydroquinoniques (5 à 20%) et un des dérivés hydroquinoniques est l’Arbutin  Flavonoïdes (0.8 à 1.5%)  Tanins : acides tannique (15 à 20%) → gallotannines  Acides organiques : acide phénolique acide gallique  Glucoside iridoïdes (monoterpéine)

12 12 Arbutin Arbutin : 4-hydroxyphenyl-β-D-glucopyranoside -β config. sur le C 1 -D config. sur le C 4 -gluco : sucre -pyrano : taille du sucre : noyau pyrane à 6côtes avec 5 atomes de C et 1 atome d’O. -Oside : glucoside → C 1 non libre

13 13 Métabolisme de l’Arbutin Arbutin Hydroquinonglucuronide Hydroquinonmonosulfate Hydroquinon

14 14 Métabolisme de l’Arbutin Carrier + Arbutin Métabolisme phase I Résorption active par transporteur glucosidique dans la partie sup. de l’intestin Carrier-Arbutin Cellules épithéliales : déglucolyse Acide glucuronique Acide sulfurique Foie Métabolisme Phase II ? Reins Hydroquinone glucuronide + Hydroquinone monosulfate Saponification par des enzymes bactériens ou par l’urine alcalin Hydroquinone libre reste à prouver substance antimicrobienne

15 15 Biodisponibilité Définition : fraction de la substance administrée qui parvient dans la circulation, c-à-d. qui sera disponible par voie systémique. Définition plus approfondie : fraction et vitesse d’une substance thérapeutique (en générale la substance active non-modifiée ou éventuellement dans le cas des « Prodrugs » le métabolite active) dans un médicament libéré, résorbé et finalement disponible à l’endroit spécifique. → substance peut ensuit être activer si nécessaire

16 16 Biodisponibilité Avant l’année 2001 Biodisponibilité Photométrique de tous les dérivées hydroquinoniques dans l’urine directe HPLC après clivage enzymatique des composés hydroquinone glucuronide et hydroquinone monosulfate de l’urine indirecte Nouvelle méthode : détermination directe de l’hydroquinone glucuronide et de l’hydroquinone monosulfate dans l’urine après la prise d’un extrait liquide aqueux de feuilles Uvae ursi folium. Après l’année 2001

17 17 Biodisponibilité Cette étude était accompagnée en parallèle par une méthode HPLC des composés hydroquinoniques en utilisant le “Coul- Array-Detection”. “Validation method for the determination of hydroquinone in human urine by high- performance liquid chromatography- coulometric-array detection” Jörg Wittig

18 18 Electrophorèse capillaire Pourquoi utilise-t-on comme méthode de séparation l’Electrophorèse capillaire? Exemple de la séparation d’un mélange contenant des composés fortement polaires ce qui rendrait une chromatographie complexe.

19 19 Electrophorèse capillaire Principe : L’électrophorèse capillaire est basée sur des différences de mobilité d’analytes chargés. Placés dans un tampon, ils migrent à différente vitesse sous l’effet d ’un champ électrique constant.

20 20 Electrophorèse capillaire Séparation basée sur la migration différentielle des solutés sous l’influence d’un champ électrique Séparation s’effectue dans des tubes de silice fondue de petit diamètre (25μm à 75μm int.) Haute voltages (10 à 30 kV) et haut champs électriques (100 à 500V/cm) sont appliqués aux extrémités du capillaire. Haute résistance du capillaire limite la génération du courant et l’effet Joule. Grande efficacité (N>10 5 à 10 6 ) et rapidité d’analyse. Détection “ en ligne” (pas de cellule externe). Petit volume d’injection (1 à 50 nl) Différents modes de séparation et application. Séparation en milieu aqueux Automatisation Désavantages ?

21 21 Electrophorèse capillaire Appareillage utilisé Appareillage d’aujourd’hui

22 22 Electrophorèse capillaire de l’Arbutin dans l’urine humain Résultat finale : Electrophérogramme de Hydroquinone Glucuronide Standard interne : (2-Hdroxyléthyl)-salicylat

23 23 Electrophorèse capillaire de l’Arbutin dans l’urine humain Résultat finale : Electrophérogramme de Hydroquinone monsulfate Standard interne : Benzoate de Na

24 24 Electrophorèse capillaire de l’Arbutin dans l’urine humain Conclusion : 1 ier groupe (6 personnes) : prise d’un extrait liquide aqueux de feuilles Uvea ursi follium 2 ième groupe (6 personnes) : prise de comprimé contenant la même quantité d’Arbutin que dans l’extrait liquide Résultat :Dans les deux cas  65% de l’Arbutin comme métabolite (H.glucuronide et H. monosulfate) éjecté dans l’urine. Conclusion :Preuve de la bioéquivalence des deux moyens médicamenteux.