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Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly.

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1 Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, Nouzilly

2 I. Définitions et processus

3 La mort cellulaire 2 types de mort cellulaire : –apoptose –Nécrose Apoptose = Mort cellulaire « programmée » ou « Programmed Cell Death » (PCD) PCD = phénomène essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques

4 Rôles de la mort cellulaire Elimination des « surplus » de cellules saines : –Embryologie (cavités, morphogénèse, structures vestigiales, cellules « en trop ») –homéostasie = constance de la masse cellulaire –processus physiologiques (cellules mammaires, endomètre, cellules épithéliales…) Suppression des cellules endommagées (défauts génétiques, vieillissement, maladies, agents toxiques…) Régulation des populations cellulaires (ex. élimination régulée de certaines populations cellulaires immunitaires)

5 Apoptose et Nécrose Leurs mécanismes et modalités de déclenchement la morphologie des cellules les conséquences tissulaires leurs significations biologiques Se différencient par :

6 Apoptose vs Nécrose Atrophie Intégrité organelles et membrane Condensation du noyau Bourgeonnement de la membrane Fragmentation (« corps apoptotiques ») Phagocytose / C voisines Pas d inflammation Turgescence Lyse des organelles et des membranes Pas de condensation Rupture des membranes Libération du contenu cellulaire Lyse de la chromatine Phagocytose tardive Inflammation

7 Nécrose Apoptose

8 Photo Molecular Probes

9 1. Nécrose : membrane et organelles Altérées, noyau + conservé x (TEM) 2. Apoptose (A) réarrangement de la chromatine (vs normal N), membrane ++ x 8000 (TEM) 3. Nécrose (SEM) x Apoptose (SEM) bourgeonnements x Cellule normale : pores nucléaires x (FF) 6. Apoptose : confluence des pores nucléaires x (FF)

10 Remarques Etats intermédiaires : –facteurs déclenchants communs –importance des ressources énergétiques (ATP) –succession apoptose puis nécrose Etat apoptotique « fugitif » inaperçu (phagocytose très rapide)

11 Un schéma simple : Caenorhabditis elegans 3 étapes : 1) apparition de signaux (externes ou internes) 2) activation de protéases cellulaires 3) formation des « corps apoptotiques » et phagocytose EGL > CED > CED > CED > Apoptose + CED-3activé Membrane CEtape intra cellulaire Inactivation Signal

12 Schéma général de l apoptose Mitochondrie AIF Cytochrome C Caspase 9 Caspases effectrices Caspase 3 (Caspases 6 et 7) Bcl2-pro Bcl2-anti Conditions physico-chimiques Ca ++ ADN, noyau P53 Cyclines TNF Fas Caspase 8 NK Perforin Granzyme B T cell CD8 Dégranulation Récepteurs de mort

13 Les signaux déclencheurs Déclencheurs extra-cellulaires : –Souvent communications entre cellules –insuffisance de signaux suppresseurs de « PCD » –augmentation de signaux inducteurs Déclencheurs intra-cellulaires –réponse à des stimuli ou à des perturbations métaboliques

14 ! Combinaison des 2 types de signaux Les récepteurs ont des rôles multiples (ex prolifération, différenciation, survie) Rôle différent du récepteur selon type cellulaire ex. récepteurs des stéroïdes Différents mécanismes d induction souvent associés

15 Insuffisance de signaux suppresseurs Cultures cellulaires : concentration, sérum, diverses molécules solubles ou liées à la membrane (variations selon le type cellulaire) Liaison cellules cibles –ex. neurones = adaptation au nombre de cibles Augmentation de signaux inducteurs Ex = perte queue des têtards = rôle de l hormone thyroïdienne Signaux extra-cellulaires

16 Signaux intra-cellulaires = lésions de la cellule produites par : drogues, toxines, chaleur, radiations, hypoxie, virus… qui ne sont pas des « inducteurs » spécifiques = « seuil de lésions » déclenchement de la PCD = activation des caspases, de protéines proapoptotiques ( voie p53 dépendante ) ou protéines kinases

17 Induction in vitro Fas ou Ac anti Fas (CD95) TNF ou ligands du TCR Pas de sérum ou de facteur de croissance UV H2O2 Glucocorticoides Ionophore calcium Camptothecine Contact lymphocytes T cytotoxiques ou NK activés + concentration cellulaire, équilibre de populations Temps nécessaire = 2 à 6 h

18 Voie Fas-L (CD 95) Fas Membrane cellulaire Fas-Ligand Fas ( trimérisation ) FADD Fas Associated protein with Death Domain Pro Cas 8 Cas 8 Pro Cas 3Autres Cas

19 Apoptosome (AIF) m Cytochrome C dATP Apaf-1 Pro Cas 9 Cyt C Caspase 9 AIF = Apoptosis Inducing Factor Apaf-1 = Apoptosis protease activating factor 1

20 Les caspases = C aspases 14 caspases et pro-caspases Cystéines protéases, résidus acide aspartique 3 groupes, selon affinité de substrat I = 1, 4, 5 ---> inflammation II= 2, 3, 7 + CED-3 ---> apoptose III = 6, 8, 9 ---> « Activation des caspases « entre elles » = « cascade » irréversible

21 Rôle très important de la caspase 3 exécuteur-clé (qq soit le stimulus) Régulation de la cascade par des protéines activatrices inhibitrices APAF1 Bcl2 FADD RIP FLASH Bcl2 Activation en présence de : ATP + cytochrome C (rôle de la mitochondrie)

22 La famille des Bcl2 Action sur les membranes mitochondriales = libération ou non du cytochrome C (proApo ou antiApo) Bax Bak Bok Bik Bin Bad Bid… Mbrane mitochondrie (Bad Bid = cytosol) Bcl2* Bclxl* Bclw Mcl1 Nr13 Al/Bfl1 (*= inhibe Cas9) + formation homodimères ou hétérodimères = régulation

23 II. Méthodes danalyse de lapoptose

24 * Membranes cellulaires = Translocation des phosphatidylsérines (Annexin V) * Mitochondries = Potentiel de membranes (sondes fluorescentes) = Libération du cytochrome C (Ac ELISA) = Libération de AIF « Apoptosis inducing factor » (Ac ELISA) * Noyau = Clivage de l ADN - Ac anti-histones - fragments (180 pb) : gel d agarose (« DNA ladder ») - TUNEL ou TdT : extrêmités 3OH - nucléosomes (ELISA) = Libération des « Nuclear Matrix Proteins » (NMPs) Ac

25 * Dosages de molécules = Récepteurs des signaux Ac FAS-L (ou Apo-1 ou CD95) TNF = Caspases Ac ou activités enzymatiques (substrats spécifiques) ==> fluorescence) = Protéines régulatrices (pro ou anti) Ac = Glutathion = calcium * Gènes impliqués

26 Cytométrie en flux et étude de lapoptose

27 Principe de la cytométrie en flux Plusieurs paramètres simultanément pour chaque cellule (jusqu'à 11 paramètres dont 8 fluorescences) Sélection de populations (analyse et tri) Analyse de cellules vivantes, grand nombre en peu de temps Cellule par cellule, quantification de la fluorescence

28 2 types de signaux Signaux de diffusion de lumière diffusion frontale de la lumière = FSC = Forward Scatter diffusion latérale de la lumière = SSC = Side Scatter Signaux de fluorescence couleur démission de fluorescence : violet, bleu, vert, jaune, orange, rouge

29 Spectres dexcitation et démission de la fluorescéine Spectre dexcitation Spectre démission Invitrogen Molecular Probes

30 Analyse monoparamétrique : exemple la fluorescence Intensité de fluorescence verte => échelle exprimée en unités arbitraires ou canaux Nombre de cellules par classe dintensité (« canal ») Témoin : autofluorescence des cellules Après marquage spécifique Population pure => une gausssienne

31 Analyse biparamétrique : exemple de deux fluorescences double marquage : amélioration de la discrimination entre les populations cellules positionnées en fonction coordonnées sur les 2 axes Intensité de fluorescence verte Intensité de fluorescence rouge Population doublement marquée Populations simplement marquées Population non marquée

32 Analyse multiparamétrique Sélection des cellules sur les paramètres de diffusion de lumière

33 Analyse multiparamétrique Marquage avec un anticorps un anti-lymphocytes T Cellules vivantes Cellules vivantes Cellules en apoptose Cellules mortes Cellules mortes Intensité de fluorescence orange Nombre de cellules par classe dintensité (« canal ») région 1 région 2

34 Pourquoi trier ? Vérification des analyses Autres analyses (cytométrie ou autre méthodologie) Mise en culture (tri « stérile ») Comment trier ? Une à quatre populations différentes Vitesse de tri maximum Cellules/s Support : lames, tubes, plaques à microtitration Milieu : « coussin », PBS, RPMI… (+ SVF) La pureté, la viabilité, la stérilité Le tri et ses options

35 Principe du tri par cytométrie Buse Drop delay Rayon laser Gouttelettes détachées Plaques de déflection V V Analyse F A « Break off »

36 Exemple de tri par cytométrie Analyse avant triRéanalyse après tri Drouet-Viard (2001) 99.6 % de pureté

37 Etapes principales de lapoptose analysées en cytométrie Récepteurs de mort caspase identification activité noyau Fragmentation « Nuclear Matrix Protein (NMP) mitochondrie membrane récepteurs altérations Potentiel de membrane calcium Pro Bcl2 AntiBcl2

38 Mise en évidence des récepteurs de mort Anticorps dirigés contre les récepteurs de mort fonctionnels : anti Fas (anti CD95) anti TRAIL (anti DR3,DR4,DR5…) anti DCR2, DCR3… => réaction immunofluorescence directe ou indirecte Kyung-Mi Kim et al (2000). Experimental and molecular medicine 32, Fixation ligand spécifique => formation complexe multiprotéique

39 Mise en évidence des protéines agissant au niveau mitochondrial Anticorps dirigés contre les protéines proapoptotiques: Bax les protéines antiapoptotiques : Bcl2 la forme tronquée de Bid (obtenu après action caspase 8) Perianayagam et al (2003). European Journal of Clinical Investigation 33,

40 Variation du calcium intracellulaire mesure du flux de Ca ++ => Fluo3 mesure quantitative du Ca ++ : - Fura-2 modification spectre dexcitation - Indo-1 modification spectre démission fluorochrome libre : émission 475nm (B) fluorochrome lié : émission 400nm (A) mesure ratiométrique sonde liée/sonde libre Etape précoce de lapoptose => augmentation du calcium intra-cellulaire Spectre d émission de l indo-1

41 Variation de calcium intracellulaire utilisation du fluo-3 Cao QZ et al (2005). World J Gastroenterol Apr 21;11(15): Cellules témoins Cellules traitées Vérapamil WangXJ, Xu JX (2005). Neuroscience Letter Mar 11, 376(2) : Induction apoptose par la roténone sur des cellules neuronales

42 Modifications membranaires Modification graduelle de la perméabilité membranaire pénétration plus facile : Hoechst ou Yo-Pro1 Perte de lassymétrie membranaire : externalisation des phospholipides AnnexineV reconnaît les phosphatidylsérines Etude du désordre lipidique membranaire externalisation des phosphatidylsérines => modification organisation membranaire => augmentation fixation merocyanine 540 discrimination cellules mortes-cellules vivantes

43 Externalisation des phosphatidylsérines Intensité de fluorescence verte (annexine V FITC) Intensité de fluorescence rouge (7AAD) Résultats A-M Chaussé (1996) Cellules vivantes Cellules mortes Cellules en apoptose

44 Externalisation des phosphatidylsérines Lignée de cellules T humaines, coloration annexineV Alexa 488 et Iodure de propidium Photo : Molecular Probes Cellule en nécrose Cellule en apoptose

45 Modifications dans la mitochondrie Action protéines proapoptotiques (Bax…) Ouverture des pores de transition modification équilibre ionique : dépolarisation de la membrane mitochondriale libération cytoplasmique du cytochrome c libération cytoplasmique des protéines SMAC/Diablo libération cytoplasmique des AIF

46 Mise en évidence de la dépolarisation de la membrane mitochondries fonctionnelles = multimères => fluorescence rouge mitochondries non fonctionnelles = monomères => fluorescence verte Intensité de fluorescence verte Intensité de fluorescence rouge Daprès Salvioli S. et al. (2000) Cytometry 40:189_197 Cellules normales Cellules en apoptose Cellules mortes fluorochromes cationiques et lipophiles incorporation potentielle dépendante => variation du potentiel mitochondrial exemple : DiOC 6, Rhodamine 123, MitoTracker, JC-1… JC-1

47 Incorporation d un fluorochrome cationique : le JC-1 Coloration d une lignée de fibroblastes au JC-1, différents temps de stimulation de l apoptose Photo : Ildo Nicoletti, Perugia University Medical School.

48 Mise en évidence de la libération cytoplasmique du Cytochrome C + Act D -Act D Coloration dune lignée de cellules T humaines Photo et Histogramme : Merck Novagen Anticorps dirigés contre le Cytochrome C

49 Activité enzymatique des caspases ===> forme active : anticorps site actif de lenzyme : Peptide spécifique (FLICA) quantification de lactivité enzymatique Procaspases précurseurs inactifs Caspases actives Substrat non fluorescentproduit fluorescent Caspase active

50 Exemple de mesure de lactivité enzymatique Activité caspase (FITC) Quantité d ADN(Iodure de Propidium) F. Guérif, V. Cadoret et D. Royère (2001) monoparamétrique activité caspase Cellules en apoptose biparamétrique : activité caspase et ploïdie

51 Fragmentation de l ADN En fin de cascade apoptotique il y a activation de nucléases qui coupent l ADN entre les nucléosomes méthode TUNEL : Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling méthode du pic hypodiploïde :

52 Méthode TUNEL Enzyme Tdt fixe des désoxynucléotides non fluorescents ou fluorescents sur lextrémité 3OH libre. Photo Molecular probes Cellule en nécrose Cellule en apoptose

53 Méthode TUNEL Utilisation de la ChromaTide BODIPY FL-14-dUTP apoptose en cours => fluorescence verte apoptose terminale : fragmentation nucléaire intense => fluorescence jaune Photo : Zbigniew Darzynkiewicz, Cancer Research Institute, New York Medical College.

54 Méthode du pic hypodiploïde Intensité de fluorescence rouge (Iodure de Propidium) Résultats M. Afanasieff (1993) Nombre de cellules par classe d intensité (« canal ») Cellules normales Cellules en apoptose Pic G0/G1 Pic G2/M coupure entre les nucléosomes => quantité ADN < 2C quantification ADN avec un fluorochrome intercalant spécifique (Iodure de propidium, Bromure déthidium…)

55 III. Apoptose et Infectiologie

56 Pathologies associées à l apoptose Apoptose excessive Alzheimer Parkinson SIDA Hépatites Certains diabètes Malformations Rejet de greffe virus, bactéries Toxines Apoptose insuffisante Maladies autoimmunes Leucémies Syndromes lymphoprolifératifs Tumeurs Ostéoporose Malformations Rejet de greffe Maladies virales (poxvirus, adenovirus) Maladies parasitaires (Toxoplasmose, Leishmaniose)

57 Trois exemples dapoptose en pathologie infectieuse Mort du macrophage infecté par des salmonelles Rôle de lapoptose dans les relations Plasmodium-vecteur Virus et régulation mitochondriale de lapoptose

58 A) Salmonellose K. HUEFFER and JE Galan, Cell.Microbiol., 2004, 6, Co-évolution pathogène-hôte = modulation des relations (ex. fonctions/mort macrophage)

59 SPI-1 : stimulée par faible O2 et forte osmolarité = phase dinvasion intestinale SPI-2 : stimulée par faible Mg++ et pH acide (intra-cellulaire) = infection systémique Les 2 protéines induisent la mort du macrophage mais différents mécanismes et temps : 45 min (SPI-1 ?) ou 24 h (SPI-2 ?) Les TTSS de Salmonella Salmonelles 2 « Type III protein secretion system » ou TTSS

60 Les questions Sagit-il dune PCD ou dune nécrose ? Mécanisme typique de PCD ? Mort identique pour tous les macrophages ? Conséquences pour le pathogène et pour lhôte ?

61 PCD ou nécrose ? - fragmentation chromatine - activation caspase 3 - nucléosomes dans cytoplasme - perte intégrité membrane - pas dactivation caspase 3 - altération des organites témoins apoptose nécrose

62 Mécanisme typique de PCD ? Rôle clé de la Caspase 1 Inhibiteurs de caspases inactifs Cytotoxicité courte ou longue Pas dactivation de la caspase 3 Différences selon les macrophages Existe sans Caspase 1 Action de protéines effectrices délivrées par TTSS ? Régulation pro ou anti- apoptotique ? Action indirecte (ex dégradation de lactine Conclusions = apoptose par différents mécanismes

63 Conséquences Stimulation du PCD / salmonelles pour limiter la réaction de lhôte ? Réponse de lhôte pour limiter linvasion bactérienne ? Souris caspase-1 - sont plus résistantes = moins pénétration des salmonelles dans la muqueuse ?

64 B) le Plasmodium et son vecteur H. Hurd and V. Carter, 2004, Int J Parasitol., 34,

65 PCD chez le parasite, le vecteur et lhôte - Chez le parasite et chez le vecteur : * images caractéristiques de PCD * blocage par les inhibiteurs de caspases des métazoaires - Chez lhôte : * l iaison présence du parasite et mort CD4+ et CD8+ ( du Fas) Les observations

66 PCD chez le parasite Pas dhomologues de caspases dans le génome autres cystéine protéases ? = «méta » et « para » caspases dont calpaine, cathepsine Différences pour létape mitochondriale (pas de p53, AIF, Apaf1 et Bcl2) Ressemblances pour les signaux inducteurs Heat shock, médicaments, lectines (con A), sérum, ROS, NO (moustique et hôte producteurs +++)

67 PCD dans le tube digestif du moustique (1) –Pas un type cellulaire précis –Ensemble de caractéristiques communes post- invasion parasitaire (très lié à la chronologie du cycle et du stade parasitaire) –Présence de caspase-3 like –Déclenchement par simple contact parasitaire –= élimination des cellules endommagées et/ou libération du parasite ? –Le parasite séchappe intact alors que sensible aux inducteurs et présence de NO (= seuils ?)

68 PCD chez le moustique (2) Réduction de fécondité du moustique / le parasite ( mRNA de vitellogénine) et PCD cellules folliculaires (reversible avec inhibiteur de caspase) = Réponse adaptative du vecteur vs stress de son parasitisme ? Un stress physiologique à la fois ? = Optimisation par le parasite de la survie de son hôte pour sa propre maturation ? Intérêt à « ménager » lhôte

69 C) Virus et modulation de PCD dans la mitochondrie P. Boya et al., 2004, Biochem. Biophys. Acta, 1659, Virus peuvent 1) augmenter PCD (dissémination, immunosuppression); 2) réduire (réplication) Variation selon les familles de virus Différentes voies daction sur PCD (TNF, PKR, P53, caspases, mitochondries)

70 Mitochondries => action « MMP », ( Mitochondrial Membrane Permeabilisation) = point central clé Virus avec : 1) induction; 2) inhibition de MMP (début du cycle) (fin du cycle infectieux) MMP déclenchée par : => Voie externe : « death receptors », caspases, MMP) => Voie interne : action directe mitochondriale « mitochondrial targeting sequence = MTS)

71 Mécanismes anti-apoptotiques Exemple du KSHV (herpes virus : sarcome de Kaposi et maladies lymphoprolifératives) Différentes protéines virales anti-PCD dont 2 localisées dans mitochondries (K7 et K15) K7 contient un MTS K7 bloque MMP induit par TNF-α, CD45 death receptor ligand, Bax… K7 a un domaine formant un pont Bcl-2 et caspase 3 activée K7 régule aussi la voie du calcium

72 VirusProteinIntracellular Localization PartnersCellular homologs Protects cells from CMVvMIAMBax, ANT Oxidants, anti-Fas, Bax, tBid, TN, TG, STS, BFA, NFX, CPX, HCQ MyxomaM11LMPBRSTS, anti- Fas, PPIX VacciniaF1LMSTS, anti- Fas KSHVK7 or vIAPM, ER, PMCAML, Bcl-2, activated caspase 3 Survivin delta-Ex3 TG, TNF-α, anti Fas K15M, ERHAX-1 EBVBHRF1MBcl-2TRAIL, t- BHP, DNA damage, virus infection HCVNS2ER (M with CIDE-B) CIDE-B Antiapoptotic viral proteins acting at the mitochondria

73 Mécanismes pro-apoptotiques Exemple du HBV (hépatite B) : Protéine X (HBx) Essentielle pour réplication virale, oncogène Sensibilisation des hépatocytes au PCD induit par # stimuli (TNF-α, TRAIL) Localisation mitochondriale, perte du ΔΨm, mort MTS identifiée et fonctions précisées HBx interagit avec 2 protéines mitochondriales (HSP60 et VDAC3) Protéines anti-PCD (Bcl2 et Bcl-Xl) protègent VDAC3 = rôle pathogène (hépatite chronique et carcinogénèse) ???

74 Proapoptotic viral proteins acting at the mitochondria Abbreviations: AEV, avian encephalitis virus; ANT, adenine nucleotide translocase; BLV, bovine leukemia virus; C, cytosolic; ER, endoplasmic reticulum; FPPS, farnesylpyrophosphate synthetase; HBV, hepatitis B virus; HIV-1, human immundeficiency virus-1; HPV, human papillomavirus; HSP, heat shock protein; HTLV-1, human T leukemia virus-1; IAV, influenza A virus; M, mitochondria; N, nucleus; VDAC, voltage-dependent anion channel; WDSV, Walleye dermal sarcoma virus

75 Séquences en relation avec lapoptose

76 1) Généralités sur l apoptose : voir « apoptosis » 2) Fournisseurs : Molecular Probes : sondes fluorescentes / Roche voir « cell biology » puis « apoptosis » Genentech : Merck : Quelques sites web intéressants

77 Laboratoire de Cytométrie Unité Infectiologie Animale Santé Publique (IASP-213) Centre de Tours tél Dominique Kerboeuf, Yves Le Vern Site web : Notre adresse


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