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PHYSIOGENOMIQUE Mathot F. ISoSL Novembre 2008. GENETIQUE = LIEN ENTRE BIOLOGIE ET COMPORTEMENTS.

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1 PHYSIOGENOMIQUE Mathot F. ISoSL Novembre 2008

2 GENETIQUE = LIEN ENTRE BIOLOGIE ET COMPORTEMENTS.

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6 DEFINITIONS PHARMACOGENETIQUE (Volgel 1957) : Lien entre gènes (ethnies ou population) et réponses aux médicaments. PHARMACOGENOMIQUE : lien entre génome (personne ou groupe) et réponse aux médicaments. EPIGENETIQUE : Influence de lenvironnement sur nos gènes. PROTEOMIQUE : Etude des protéines (structures et fonctions). + complexe que génomique : génome = constant et protéome varie de cellules à cellules. METABOLOMIQUE : Etude systémique des empreintes chimiques que les processus cellulaires laissent derrière eux. Métabolome = collection de tous les métabolites (par ex dune cellule).

7 EPIGENETIQUE : Exemple

8 PHARMACOGENETIQUE La pharmacogénétique permet détablir un lien entre le polymorphisme de la structure génique (le génotype) et la variabilité de la réponse à leffet dun médicament (le phénotype) Objectifs => Améliorer la maîtrise de la variabilité interindividuelle Individualiser le traitement médicamenteux : choix de la molécule mais aussi posologie et rythme dadministration

9 PHARMACOGENOMIQUE : =Etude des variations interindividuelles à lintérieur de génomes complets dans le but de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques ou didentifier des différences entre lexpression des gènes et la réponse aux différents médicaments. Grand intérêt pour la genèse de nouveaux médicaments. (plus de 100 médicaments produits par génie génétique sont déjà utilisés).

10 EMEA : HARMONISATION AVEC FDA. La pharmacogénomique désigne tous les éléments de modifications de lexpression des gènes qui altèrent la réponse aux médicaments.

11 CODE GENETIQUE. Code universel inscrit dans le matériel génétique avec toutes les informations nécessaires à la fabrication des protéines. Chaque triplet de nucléotides ou codon est spécifique pour un acide aminé. Le fondement de lhérédité repose sur la relation entre la séquence des nucléotides et la séquence des acides aminés. Un codon (triplet) code pour un acide aminé. Un cistron code un polypeptide. Un exon code une chaîne polypeptidique indispensable à la synthèse dune protéine. Un intron est une séquence non codante située entre 2 fragments codants pour un polypeptide (exon) dun gène.

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13 CODE GENETIQUE / CODON. En génétique, les codons sont des triplets de nucléotides (A-Tou U, C-G) Il existe 4³ = 64 combinaisons possibles de ces 4 lettres en triplets. Il y a 3 codons « stop ». Aux 61 autres codons correspondent les 20 acides aminés. Ainsi, en moyenne, une mutation sur 3 affectant une séquence dADN codante nnentraîne aucune modification de la protéine traduite. Le code génétique permet la synthèse des protéines. LADN est transcrit en ARN messager (ARNm). Celui-ci est traduit par les ribosomes qui assemblent les Acides aminés sur des ARN-transfert (ARNt). LARNt contient un « anti-codon », complémentaire dun codon et porte lacide aminé correspondant au codon. Pendant la traduction, le ribosome lit lARNm codon par codon, met en relation un codon de lARNm avec lanti-codon dun ARNt et ajoute lacide aminé porté par celui-ci à la protéine en cours de synthèse.

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15 CCODE GENETIQUE.

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18 POLYMORPHISME -On estime que la génétique intervient pour 20 à 95% dans la variabilité des effets des médicaments. -Ces différences sont dues à des variations dans les séquences des gènes codant soit: des enzymes métabolisants, des transporteurs des récepteurs. -Le polymorphisme a surtout lieu sur des nucléotides particuliers (SNP) : on a identifié SNP dont se situent dans une région codante d un gène. Aujourdhui, près de SNP ont été identifié et la statistique projette SNP environ. -Influence polygénique sur les caractéristiques pharmacocinétiques et pharmacodynamiques.

19 SNP : Polymorphisme dun nucléotide. Un SNP peut mener à une substitution dun acide aminé dans la séquence dune protéine altérant celle-ci. Par ex : le remplacement valine par glutamate en position 6 de la chaîne hémoglobine globule rouge plus rigide en forme de faux anémie falciforme. Chaque individu possède une collection unique de SNP qui explique les variations notamment dans la réponse aux médicaments. Chaque cellule contient 46 chromosomes et environ gènes pour 6 milliards de bases. La bio-statistique avance un SNP pour 1000 bases. 7 millions de SNP différents entre 2 individus non proches.

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25 Hirokane, 1999, Halopéridol TDM (n:231) : la Css (conc. Plasma. Au steady state) ajustée varie de 11 fois. De Leon 2004, T1/2 Halopéridol de 14,5 hr à 36,7 hr mais après administration chronique, il rapporte des T1/2 de 21 jours. Castberg, 2005, TDM routine Risperdal Consta après 14 jours : 25mgr : 38 nmol/L, 37,5mgr : 67 nm, 50mgr : 99nm et 75mg : 148. C/D (conc plasma/dose/24hr) médiane est de 22,2 nmol/L/mgr/24hr pour le groupe IM (n:30) et de 18,6 pour le groupe oral (n:278). Kramer 2000, Quetiapine, même dose, Css varie de 40 fois. Hasselstrom 2004, TDM Quetiapine (n:62) C/D varie de 238 fois. Olesen 1999, TDM Olanzapine (n:56) C/D varie de 26 fois. Gex 2003, TDM Olanzapine (n:250) : si : femme, âgée, non fumeuse et + fluvoxamine alors Css Olanzapine 4,6 fois plus élevée que si homme, jeune, fumeur et + carbamazépine.

26 La demi-vie plasmatique est différente de la demi-vie dynamique. (Kapur 2002). -Olanzapine: demi-vie : plasma : 24,2 hrs : striatum : 75,2 hrs (50% occupation D2) -Rispéridone : plasma : 10,3 hrs : striatum : 66 hrs

27 Posologie et Psychiatrie. Dose-effet (plasma) Concentration-effet (site récepteur). La dose reste fixe tandis que la conc. varie en fonction de : durée-sujet-métabolite actif- isomère et la sensibilité des cibles varie aussi selon le sujet, la période, la pathologie, la comédication, lenvironnement, alcool, tabac. Combien de fois?

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29 Conséquences de la variabilité génétique

30 50% des médicaments exercent leurs effets au niveau dun récepteur membranaire. 30% interagissent avec une enzyme. 5% agissent sur un canal ionique. Transporteurs ?, Pompes P-gp ? On estime que 1% des bases du génome humain peut varier et quau moins 28% (50% ?) des enzymes humaines sont polymorphes.

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32 TargetGeneDrugPotential ADR Dopamine D3 receptorsDRD3Antipsychotics (dopamine antagonists) Drug-induced tardive dyskinesia Delta Opioid receptorsOPRM1Methadone, Heroin, Fentanyl Addiction Potassium channelKCNH2 (HERG)cisapride, quinidineDrug-induced LQT/TdP Potassium channelKCNE2ClarithromycinDrug-induced arrhythmia Ryanodine receptorRYR1Halothane, suxamethoniumHyperthermia Beta2-adrenergic receptorBeta2-ARSalbutamolLack of efficacy LQT, Long QT. TdP, torsades de pointes. Examples of drug targets with identified genetic polymorphisms associated ADRs RECEPTEURS : Exemples de Polymorphismes et ADRs.

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34 Le remplacement de l arginine 1644 par une histidine au niveau S4 du domaine IV inactive le canal sodique.

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37 FIG. 2. Selected transport mechanisms along the BBB. A general depiction of the polarized expression of transporters for drugs and essential nutrients on a BBB endothelial cell. The arrows indicate the direction of transport. For a more descriptive representation of the major drug transport systems in the BBB [organic cation and anion transporters, nucleoside transporters (N2, es, and ei), and efflux systems (P-gp and MRP)], please refer to Figs. 4, 5, 6, and 7. Adapted from Betz et al., 1980; van Asperen et al., 1997.

38 ACIDES AMINES Le cerveau est le seul organe où le transport des acides aminés est limité et même aux concentrations plasmatiques normales, il y a compétition pour le passage des membranes (BBB). Tyr et Tryp sont en compétition avec val, leu, isoleu et phenylala. Schizophrenie : Les 4 A.A. sont augmentés; les conc. plasma. en tyr sont inchangées mais compétition pour le transport vers le cerveau avec moins de tyrosine disponible càd de dopamine. Une diminution de Tyr est aussi signalée dans lautisme et chez des bipolaires. On remarque une diminution de Tryp chez les non répondeurs aux AP atypiques; cette résistance pourrait être liée à un déficit de synthèse de 5HT dans le SNC.

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40 FIG. 5. Organic anion transport systems in the BBB and CP. The proposed topology for rat OAT1 is shown. P, phosphorylation sites. In addition to the transport of a variety of organic anions across the brain barriers, the active uptake of digoxin across the BBB and the secretion of estrogen conjugates and opioid peptides across the CP have been reported. Only the OAT systems that have been experimentally localized to a specific side of the BBB endothelium and CP epithelium are shown. Arrows indicate the direction of transport. Adapted from Sekine et al., 2000.

41 FIG. 7. P-gp and MRP efflux systems in the BBB and CP. The predicted membrane topology models for MRP1 and P-gp are provided. MRP2, -3, and -6 have structures similar to MRP1 and are characterized by an extra N-terminal extension (i.e., five transmembrane segments connected to a P-gp-like core by a cytoplasmic linker). Both MRP4 and -5 lack this additional transmembrane domain but contain the cytoplasmic linker in addition to the P-gp-like core. ABD, ATP-binding domain. Only the efflux systems that have been experimentally localized to a specific side of the BBB endothelium and CP epithelium are presented. Arrows indicate the direction of transport. Adapted from Ueda et al., 1997; Borst et al., 1999.

42 Le gène MDR-1 (multidrug resistance) Code pour une protéine appelée « P-glycoprotein » (PGP) PGP exprimée dans divers types cellulaires : produit l extrusion de diverses molécules de l intérieur de la cellule vers l extérieur PGP impliquée au départ dans le développement de la résistance de tumeurs à divers médicaments cytostatiques (par de la concentration intracellulaire de ceux-ci) PGP exprimée notamment au niveau de l intestin et de la BHE : divers médicaments non-cytostatiques (p.e. digoxine, ciclosporine, vérapamil, terfénadine, inhibiteurs de la protéase du HIV) sont des substrats gène MDR-1 très polymorphique :1 polymorphisme (C3435T) corrélé avec Cmax de la digoxine PGP induite par la rifampicine : nouveau mécanisme d interaction médicamenteuse

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47 Figure 3. Functional Consequences of Genetic Polymorphisms in the Human P-Glycoprotein Transporter Gene ABCB1 (or MDR1). The schematic diagram of the human P-glycoprotein was adapted from Kim et al., 18 with each circle representing an amino acid and each color a different exon encoding the corresponding amino acids. Two single-nucleotide polymorphisms in the human ABCB1 gene have been associated with altered drug disposition (Panels A, B, C, and E) or altered drug effects (Panel D). The synonymous single- nucleotide polymorphism (a single-nucleotide polymorphism that does not alter the amino acid encoded) in exon 26 (the 3435C" border=0 src="/math/rarr.gif"T single-nucleotide polymorphism) has been associated with higher oral bioavailability of digoxin in patients homozygous for the T nucleotide (Panel A [C max denotes maximal concentration]) 19 but lower plasma concentrations after oral doses of fexofenadine (Panel B) 18 and nelfinavir (Panel C). 20 This single-nucleotide polymorphism has also been linked to better CD4 cell recovery in HIV-infected patients who are treated with nelfinavir and other antiretroviral agents (Panel D). 20 The single-nucleotide polymorphism at nucleotide 2677 (G" border=0 src="/math/rarr.gif"T) has been associated with lower plasma fexofenadine concentrations in patients homozygous for the T nucleotide at position 2677 (Panel E). 18 The panels have been adapted from Kim et al., 18 Hoffmeyer et al., 19 and Fellay et al. 20

48 Génotype TT et passage placentaire. Le génotype maternel régule (foie) le métabolisme des médic. jusquau placenta mais les caractéristiques génétiques du placenta sont déterminées par le fœtus. Difficultés de prédiction de lexposition médic. du fœtus du fait de la juxtaposition de 2 génotypes. Ex. : génotypes P-gp CC, CT ou TT : un double TT (mère et fœtus) amène une exposition accrue pour le fœtus car moins de P-gp. Le génotypage de la mère et du fœtus (amniocentèse) pourrait aider le choix dun médicament afin de minimiser les ADR potentiels. Ex : Sertraline : P-gp inhibiteur, augmente la conc. et la 1/2vie de rispéridone et 9OH-risp. et la sertraline est un substrat CYP 2D6, 3A4, 2C9, 2C19. Importance des CYP et des P-gp importance dune TDM chez la femme enceinte sous sertraline

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51 P-gp et rispéridone : La rispéridone est un substrat à forte affinité pour les P-gp : Le rapport conc. Risp et 9-OH risp. dans le cerveau et le plasma de souris KO ou normales est de 14 et 11 respectivement. P-gp et Méthadone (R et S) (P-gp substrat) : Tt méthadone : grandes variabilités interindividuelles. Les conc. cérébrales de R et S-Méthadone sont 15 et 23 x plus élevées chez les souris KO. Les P-gp limitent fortement lentrée de la méthadone dans le cerveau et elles peuvent être source de variation de ses effets dans le cerveau.

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58 Slide 58. Regulatory Mechanisms of CYP3A and MDR1 Expression The pregnane X receptor (PXR), also known as steroid and xenobiotic-sensing receptor (SXR), heterodimerizes with the retinoid X receptor (RXR). This heterodimer binds response elements upstream of the MDR1 and CYP3A genes. In this way, PXR can increase the transcription of CYP3A [37] and MDR1. [38] Moreover, binding motifs for the PXR have been identified on multiple rat CYP enzymes (CYP3A1, -3A2, -1A6, -2A1, -2A2, -2C6) as well as a P450 coenzyme, NADPH reductase. [39]

59 CYP 450 ET POLYMORPHISME GENETIQUE DU METABOLISME DOXYDATION Distribution de fréquence dallure trimodale 3 phénotypes métaboliseurs lents (PM) : indice de métabolisation (MR) > 12, % population caucasienne intermédiaires (EM) : 0,2 < MR < 12,6 ultrarapides (UM) : MR < 0,2

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61 LE POLYMORPHISME GENETIQUE DU METABOLISME DOXYDATION Y Conséquences cliniques - Métaboliseurs lents accumulation de la molécule, plus sujets aux effets indésirables pas deffet thérapeutique des prodrogues exemple : absence deffet analgésique de la codéine codéine morphine CYP 2D6 - Métaboliseurs ultra rapides : absence de réponse thérapeutique

62 LE POLYMORPHISME GENETIQUE DU METABOLISME DOXYDATION Y Support génétique méchanismes moléculaires du polymorphisme génétique A - simple nucléotide dans une région codante : substitution dacides aminés dans une région non codante : séquence de régulation : sous ou sur production de protéines actives intron : ARNm inapproprié, erreurs post traductionnelles, modification d activité enzymatiques B - délétion, duplication génique Y exemple de lallèle *4B du CYP 2D6 53 exon 3exon 4 G = > A enzyme normale : 497 aaenzyme mutée *4B : 181 aa, inactive

63 Mutations les plus communes du CYP2D6

64 Figure 4. Pharmacogenetics of Nortriptyline. Mean plasma concentrations of nortriptyline after a single 25-mg oral dose are shown in subjects with 0, 1, 2, 3, or 13 functional CYP2D6 genes. Modified from Dalén et al. 23 with the permission of the publisher.

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66 UGT 1A1 Polymorphismes. Uridine Diphosphate glucuronyl transférase. US : 3 notices avec recommandations pour testing pharmacogénétique : Irinotecan (campto), 6-mercaptopurine (imuran), warfarin. UGT : superfamille enzymes (17) de glucuroconjugaison. Très polymorphique : 60 isoformes. Irinotecan (inhibiteur de topoisomérases) : prodrug SN-38, mét. Actif conjugué par UGT 1A1. Si allèle UGT 1A1*28 (TA)7 au lieu de (TA)6 pour le WT : UGT 1A1*1 activité – 70% neutropénie,diarrhées sévère, bilirubine ++. Allèle UGT 1A1*16 (Gly Arg) : activité – 40% Irinotecan aussi substrat pour P-gp att. polymorphisme ABCB1. Les inhibiteurs des protéases inhibent le UGT 1A1 bilirubine ++ et att. ictère. UGT 1A1 testing : 255 usd

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68 UGT 1A1 : Substrats, Inducteurs et Inhibiteurs.

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71 DEFICIT EN CARNITINE : -Inhibition du transport des fragments acyls issus de la Bêta- oxydation avec accumulation et blocage du métabolisme mitochondrial. -Manifestations cliniques : atteintes: Musculaires (muscles striés, cardio-myopathie). Neurologiques (œdème cérébral, coma). Hépatiques : (hypoglycémie, hyperammoniémie, acidose métabolique, syndrome de Reye). Les déficits peuvent être primaires (défaut génétique en acyl-CoA déshydrogénase, CPT 1, CPT 2, cycle de l urée) ou secondaires ou acquis par déplétion des stocks : hémodialyse, insuffisance d apport :TPN, médicaments : acide valproique, pivampicilline.

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76 NRG1 : neuregulin 1; DTNBP1 : dysbindin; RGS4 : regulator G-protein signaling 4; COMT : catechol-o-methyltransferase; PRODH : prolin deshydrogenase; DISC1 : disrupted-in-schizophrenia. +++ = at least three positive studies. Proline eseentielle pour synthèse glutamate et GABA.

77 Cependant, passer au crible les 10 millions de SNP courants qui se trouvent dans les chromosomes dun patient serait un processus extrêmement coûteux. Pour la schizophrénie, des dizaines voire des centaines de variables génétiques sont quelque peu prédictives du risque de schizohrénie mais aucune nest cliniquement utile par elle-même. Il sagit dexaminer ces gènes qui ont tous un petit effet et de créer un algorithme pour prédire les risques éventuels. Le développement de HapMap permettra aux généticiens de tirer profit de lorganisation des SNP et des autres variations génétiques dans les chromosomes.

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80 Maladie dAlzheimer : dépistage plus tôt.

81 Autisme : prédispositions : chaque point correspond à un locus lié positivement à lautisme.

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83 Ethanol : Pharmacogénétique Grande variabilité de lADME de lalcool due aux facteurs génétiques et environnementaux. CYP2E1 augmenté dans lalcoolisme chronique et des polymorphismes du CYP2E1 seraient impliqués dans certains cancers (estomac) et pancréatites chez léthyl. 7 gènes encodent pour lADH dont 2 polymorphes : LADH2*1 2x moins vite que le ADH1 (wt) et lADH2*2 métabolise 15x plus vite que le wt avec risque daccumulation toxique dacétaldéhyde. 2 gènes encodent pour lALDH avec 2 allèles dont un est inactif; rare chez les caucasiens, il est présent chez 40% des orientaux avec risque daccumulation dacétaldéhyde.

84 5HTTLPR : transporteur de la sérotonine.

85 HLA : Human Leukocytes Antigens systems Le chromosome 6 contient une région connue comme : MHC = major histocompatibility complex. 60% des gènes de cette région codent pour des protéines impliquées dans les réponses immunologiques dont le système HLA, vital pour nos défenses antiinfectieuses. Afin de couvrir le large spectre antiinfectieux, cest le système le plus polymorphe du génome humain. Malheureusement, cette large variabilité augmente aussi le risque de développements aberrants chez certains individus pouvant mener à des maladies auto-immunes et dans le cas de médicaments, à des réactions allergiques sévères.

86 Allele or haplotype DrugADR associated with HLA HLA-B*1502 CarbamazepineStevens-johnson syndrome HLA-DRB1 *1501, HLA-DQB1 *0602, HLA-DRB5*0101 Amoxicillin-clavulanic acidHepatitis HLA-DQ7Pyrazolones Pyrazolone hypersensitivity HLA-A29, HLA-B12, HLA-DR7 SulfonamidesToxic epidermal necrolysis HLA-B38, HLA-DR4, HLA-DQ3, HLA-Cw*7, HLA-DQB *0502, HLA-DRB*0101, HLA-DRB3 *0202 ClozapineAgranulocytosis HLA-B *5701, HLA-DR7, HLA-DQ3 AbacavirAbacavir hypersensitivity reactionj HLA-DR4 HydralazineSystemic lupus erythematosus Examples of HLA alleles and halotypes associated with ADRs HLA : human leukocytes antigens systems.

87 GeneNameAllele of AA changeEffect on phenotype B2ARβ 2 -adrenergic receptorArg16/GlyReduced response to β 2 agonists Gln27/GluIncreased response to β 2 agonists B1ARβ 1 -adrenergic receptorR389GReduced response to β-agonists ALOX55-lipoxygenaseGGGCGG Reduced response to leukotrienes LTC4SLeukotiene C4 synthaseA2444CIncreased response to zafirlukast in C/A;CC GNB3G-protein B3C825TIncreased response to sibutramine in T/C;TT subjects LIPCHepatic lipaseC514TReduced response to statins in T/C;T/T subjects UGTA1UDP-glucoronosyl transferase1A1UGRA1*28Increased toxicity to irinotecan TYMSThymidylate synthaseTSER*2/*3Reduced response to 5-fluorouracil MTHFRMethylene tetrahydrofolate reductaseC677TIncreased toxicity to methotrexate ABCB1P-glycoprotein-1 (MDR1)C343TDecreased response to antiepileptic drugs AGTAngiotensinogenM235TIncreased response to antihypertensive drugs DRD3Dopamine D3 receptorS9GReduced response to clozapine HTR2ASerotonin receptor 2AH452YReduced response to clozapine Variable number tandem repeat in promoter. AA: Amino acid Table 1. Examples of Genetic Polymorphisms Affecting Drug Response

88 Central Orexigenic NPY, Melanin, AgoutiRP Orexins, galanin Central Anorectic : CART, glucagon, Melanocortins, CRF, 5HT, Neurotensin. Periph Orexigenic Ghrelin. Periph Anorexic. PYY, Leptin, Insulin, Cholecystokinin. CART = cocaine amphetamine regulated transcript.

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95 APPROCHES INDUSTRIELLES OUTILS BIOINFORMATIQUES : pour analyser la carte du génome humain. OUTILS DE SEQUENCAGES : pour générer les bio- marqueurs. OUTILS DE GENOTYPAGE : pour comparer les polymorphismes entre les populations. OUTILS BIOSTATISTIQUES : pour étudier lassociation des biomarqueurs et des gènes aux caractéristiques cliniques.

96 BIOMARQUEUR GENOMIQUE. = caractéristique mesurable de lADN ou ARN qui est un indicateur : -de diagnostic : le biomarqueur permet didentifier une maladie. -de pronostic : détermine lévolution prévisible de la maladie. -de dynamique : rend compte de leffet du médicament. -de toxicité : analyse les effets indésirables. -de pathologie : mesure de la maladie, de ses conséquences. On parle de puce à ADN, puce à gènes, biopuce, biochips, microchips, DNA-microarrays, microarrays

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98 TESTS GENETIQUES : UTILES OU ARNAQUE ? Dans la grande majorité des cas (plus de 1000 tests recensés aux USA) = ARNAQUE ! Il faudrait analyser 1500 protéines !!!! Rares sont les tests validés par la FDA : UGTA1, Chips CYP450… Les autres nont aucune valeur prédictive individuelle : difficulté dinterpréter les données : un SNP identique peut être sérieux chez une personne et bénin chez une autre en fonction de la race, de lenvironnement, de la pathologie…. Si nous pouvions tout prédire, nous irions vers une Société sans espoir….. Par contre, utilité pour les maladies monogéniques (environ 50 dont 20 sont génétiquement identifiée (huntington, dystrophie, mucoviscidose, hémophilie, phénylacétonurie, anémie falciforme etc..).

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