La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Transfection CaPO 4 101 Dave Bélanger. Théorie Mécanisme inconnu Hypothèses: 1.Le précipité formé par le CaCl2 et lADN est endocytosé par la cellule et.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Transfection CaPO 4 101 Dave Bélanger. Théorie Mécanisme inconnu Hypothèses: 1.Le précipité formé par le CaCl2 et lADN est endocytosé par la cellule et."— Transcription de la présentation:

1 Transfection CaPO Dave Bélanger

2 Théorie Mécanisme inconnu Hypothèses: 1.Le précipité formé par le CaCl2 et lADN est endocytosé par la cellule et lADN est ensuite dirigé vers le noyau (Maniatis Tome 3 p16.32). 2.Le CaCl 2 sionise en solution. Les ions Ca 2+ générés déstabilisent léquilibre ionique au pourtour de la cellule et ces derniers traversent la membrane par osmose. Les pompes calciques fonctionnent alors à plein régime pour évacuer le Ca 2+ intracellulaire. Se faisant, il se pourrait que la cellules soit plus permissives à lentrée de plasmides(par exemple) soit par endocytose ou directement via la pompe calcique. (http://www.madsci.org/posts/archives/feb2000/ Cb.r.html)http://www.madsci.org/posts/archives/feb2000/ Cb.r.html 3.Le déséquilibre des ions Ca 2+ (intra-et extracelulaire) pourrait aussi créer un changement de voltage à la membrane cellulaire, ce qui rendrait la cellule plus perméable. (http://www.madsci.org/posts/archives/feb2000/ Cb.r.html)

3 Protocole: 1- La veille, ensemencer les 293T ( cellules /puit 6p) (2x10 6 cellules / T75) 2- Retirer le milieu des cellules et ajouter 2ml/puit 6p 9ml/T75 3- Préparer les mélanges: 1 puit 6p1 T75 x ul H2Ox ul H2O ulCaCl262.5 ul CaCl2 6ug ADN30-40 ug ADN 100 ul 500ul 4- Distribuer goutte à goutte le mélange ci-dessus dans un volume égal de HBS 2X (En injectant de lair dans le HBS avec un pipet-aid ou en vortexant légèrement)

4 Protocole (suite): 5- Laisser reposer environ 20 minutes à température pièce. 6- Confirmer visuellement labsence de gros précipité blanc dans le tube. Sil y en a, jeter. Le précipité doit être minuscule. 7- Distribuer goutte à goutte sur les cellules. 8- Incuber à 37C + 5% CO2. 9- Après de 6h à 24h, laver 2 fois au PBS et mettre du milieu frais. 10- Récolter 48h post-transfection

5 Sources de problème: Solution (75% du temps) ADN (20% du temps) Cellules (5% du temps) Manipulation (ça arrive…)

6 Solutions

7 Solutions: CaCl 2 :2M CaCl 2 2 H 2 0 (Fisher lot )5.88g 20 ml Filtrer 0.22 m, aliquoter, garder à 4°C H 2 0:Prendre la même eau que celle utilisée pour faire les solutions ci-haut, filtrer 0.22 m, garder à 4°C HBS 2X:280mM NaCl (Fisher)1.6g 10mM KCl (Fisher lot )0.075g 1.5mM NaH2PO4 (MAT lot 2834A)0.021g 12mM Dextrose (Fisher lot A)0.2g 50mM HEPES (JT Baker lot A01650)1.2g 100 ml Ajuster pH entre 7.06 et 7.12 avec NaOH (avant et après avoir complété à 100 ml) Filtrer 0.22um, aliquoter, congeler à -20°C

8 Solutions (suite): 1.Le pH est le facteur le plus crucial. Avant de lajuster, calibrer le pH-mètre 2.avec les 3 solutions étalons et changer le KCl de lélectrode. 3.Lajustement doit se faire au centième près, de façon précise et exacte. 4.(pH à confirmer) 5.Utiliser toujours les même poudres (vérifier les numéros de lots) 6.Éviter les cycles gel-dégel pour le HBS 7.Expiration des solutions: environ 6 mois à -20°C

9 ADN

10 1.Purification QIAGEN: Le kit de Sigma peut être bon mais semble présenter plus de variabilité. 2.De 3 à 5 ug dADN par ml (3ug/ml est amplement suffisant pour Nl4-3wt). 3.Un ADN visqueux est lindice dune trop grande concentration. Il est préférable de le diluer et le doser de nouveau pour avoir une distribution uniforme de lADN en solution. 4.Éviter de vortexer lADN. Up/down avec un embout est préférable. 5.Lanalyse sur gel est important afin de déterminer la qualité de lADN. (Dégradation, présence de dADN génomique, bande inexpliquée…)

11 Exemple Les trois formes de lADN Analyse sur gel DégradéGénomiqueParfait

12 Cellules

13 En culture: Maintenir à une confluence acceptable (Max 80%) Passage maximal à déterminer Ensemencement: En T75, cellules par flasque le vendredi donne un flasque à 60% le lundi. Lors de la transfection: Entre 25 et 50% de confluence. 6 puits: Ensemencer cellules/puit la veille T-75: Ensemencer 2x10 6 cellules/flasque la veille

14 Cellules trop compactées Cause possible:Mauvais étalage suite à lensemencement, combiné à une attente trop longue entre les passages Cellules ensemencées à trop faible densité

15 Croissance en 3 dimensions Cause possible: Mauvais bris des liens inter-cellulaires suite à la trypsination

16 Surconfluence Malgré lapparence dun 85-90% de confluence, beaucoup de cellules se sont détachées et flottent: Signe de surconfluence

17 … Cause possible: …

18 Évaluer la confluence

19 20% 25% 40% 50% 85% 100% 65%

20 Prêtes à la transfection Limite inférieure acceptable Limite supérieure acceptable

21 Manipulations

22 Manipulations: 1.Vortex et ADN ne font pas bon ménage 2.Température des solutions (Température pièce) 3.Incubateur à 5% CO2 4.Mélange Calcium-HBS = 1/10 du volume final (ex 1 ml dans 10 ml pour T-75) 5.Gros précipité: 1.Mélange trop rapide de ADN-CaCl 2 et HBS provoque formation rapide du précipité ce qui le rend trop gros et impropre à une transfection efficace. 2.Gros ADN ou trop grande concentration 3.pH des solutions

23 Ça marche aussi… Transfection le matin, laver 6 heures après. En 6 puit, transfecter dans 1 ml au lieu de 2ml nécessite moins de réactifs et est aussi efficace. Chloroquine: Prévient la dégradation de lADN par le lysosome Mettre 100 M final pendant la transfection et laver après 3 à 6 heures

24 Nouveauté: Cellules 293T dégelé par lassistant de recherche Nouvelle boite « Production virale » contient les plasmides Solutions HBS et CaCl 2 fabriquées maison


Télécharger ppt "Transfection CaPO 4 101 Dave Bélanger. Théorie Mécanisme inconnu Hypothèses: 1.Le précipité formé par le CaCl2 et lADN est endocytosé par la cellule et."

Présentations similaires


Annonces Google