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Transfection CaPO4 101 Dave Bélanger.

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1 Transfection CaPO4 101 Dave Bélanger

2 Théorie Mécanisme inconnu Hypothèses:
Le précipité formé par le CaCl2 et l’ADN est endocytosé par la cellule et l’ADN est ensuite dirigé vers le noyau (Maniatis Tome 3 p16.32). Le CaCl2 s’ionise en solution. Les ions Ca2+ générés déstabilisent l’équilibre ionique au pourtour de la cellule et ces derniers traversent la membrane par osmose. Les pompes calciques fonctionnent alors à plein régime pour évacuer le Ca2+ intracellulaire. Se faisant, il se pourrait que la cellules soit plus permissives à l’entrée de plasmides(par exemple) soit par endocytose ou directement via la pompe calcique. (http://www.madsci.org/posts/archives/feb2000/ Cb.r.html) Le déséquilibre des ions Ca2+(intra-et extracelulaire) pourrait aussi créer un changement de voltage à la membrane cellulaire, ce qui rendrait la cellule plus perméable. (http://www.madsci.org/posts/archives/feb2000/ Cb.r.html)

3 Protocole: 1- La veille, ensemencer les 293T ( cellules /puit 6p) (2x106 cellules / T75) 2- Retirer le milieu des cellules et ajouter 2ml/puit 6p 9ml/T75 3- Préparer les mélanges: 1 puit 6p 1 T75 x ul H2O x ul H2O ul CaCl ul CaCl2 6ug ADN ug ADN 100 ul ul 4- Distribuer goutte à goutte le mélange ci-dessus dans un volume égal de HBS 2X (En injectant de l’air dans le HBS avec un pipet-aid ou en vortexant légèrement)

4 Protocole (suite): 5- Laisser reposer environ 20 minutes à température pièce. 6- Confirmer visuellement l’absence de gros précipité blanc dans le tube. S’il y en a, jeter. Le précipité doit être minuscule. 7- Distribuer goutte à goutte sur les cellules. 8- Incuber à 37C + 5% CO2. 9- Après de 6h à 24h, laver 2 fois au PBS et mettre du milieu frais. 10- Récolter 48h post-transfection

5 Sources de problème: ADN (20% du temps) Cellules (5% du temps)
Solution (75% du temps) ADN (20% du temps) Cellules (5% du temps) Manipulation (ça arrive…)

6 Solutions

7 Solutions: HBS 2X: 280mM NaCl (Fisher) 1.6g
10mM KCl (Fisher lot ) g 1.5mM NaH2PO4 (MAT lot 2834A) g 12mM Dextrose (Fisher lot A) 0.2g 50mM HEPES (JT Baker lot A01650) 1.2g 100 ml Ajuster pH entre 7.06 et 7.12 avec NaOH (avant et après avoir complété à 100 ml) Filtrer 0.22um, aliquoter, congeler à -20°C CaCl2: 2M CaCl2 2 H20 (Fisher lot ) 5.88g 20 ml Filtrer 0.22mm, aliquoter, garder à 4°C H20: Prendre la même eau que celle utilisée pour faire les solutions ci-haut, filtrer 0.22mm, garder à 4°C

8 Solutions (suite): Le pH est le facteur le plus crucial. Avant de l’ajuster, calibrer le pH-mètre avec les 3 solutions étalons et changer le KCl de l’électrode. L’ajustement doit se faire au centième près, de façon précise et exacte. (pH à confirmer) Utiliser toujours les même poudres (vérifier les numéros de lots) Éviter les cycles gel-dégel pour le HBS Expiration des solutions: environ 6 mois à -20°C

9 ADN

10 ADN Purification QIAGEN: Le kit de Sigma peut être bon mais semble présenter plus de variabilité. De 3 à 5 ug d’ADN par ml (3ug/ml est amplement suffisant pour Nl4-3wt). Un ADN visqueux est l’indice d’une trop grande concentration. Il est préférable de le diluer et le doser de nouveau pour avoir une distribution uniforme de l’ADN en solution. Éviter de vortexer l’ADN. Up/down avec un embout est préférable. L’analyse sur gel est important afin de déterminer la qualité de l’ADN. (Dégradation, présence de d’ADN génomique, bande inexpliquée…)

11 Analyse sur gel Les trois formes de l’ADN Exemple Dégradé Génomique
Parfait

12 Cellules

13 Cellules En culture: Maintenir à une confluence acceptable (Max 80%)
Passage maximal à déterminer Ensemencement: En T75, cellules par flasque le vendredi donne un flasque à 60% le lundi. Lors de la transfection: Entre 25 et 50% de confluence. 6 puits: Ensemencer cellules/puit la veille T-75: Ensemencer 2x106 cellules/flasque la veille

14 Cellules trop compactées
Cause possible: Mauvais étalage suite à l’ensemencement, combiné à une attente trop longue entre les passages Cellules ensemencées à trop faible densité

15 Croissance en 3 dimensions
Cause possible: Mauvais bris des liens inter-cellulaires suite à la trypsination

16 Surconfluence Malgré l’apparence d’un 85-90% de confluence, beaucoup de cellules se sont détachées et flottent: Signe de surconfluence

17 Cause possible: …

18 Évaluer la confluence

19 40% 25% 20% 85% 50% 65% 100%

20 Prêtes à la transfection
Limite supérieure acceptable Limite inférieure acceptable

21 Manipulations

22 Manipulations: Vortex et ADN ne font pas bon ménage
Température des solutions (Température pièce) Incubateur à 5% CO2 Mélange Calcium-HBS = 1/10 du volume final (ex 1 ml dans 10 ml pour T-75) Gros précipité: Mélange trop rapide de ADN-CaCl2 et HBS provoque formation rapide du précipité ce qui le rend trop gros et impropre à une transfection efficace. Gros ADN ou trop grande concentration pH des solutions

23 Ça marche aussi… Transfection le matin, laver 6 heures après.
En 6 puit, transfecter dans 1 ml au lieu de 2ml nécessite moins de réactifs et est aussi efficace. Chloroquine: Prévient la dégradation de l’ADN par le lysosome Mettre 100 mM final pendant la transfection et laver après 3 à 6 heures

24 Cellules 293T dégelé par l’assistant de recherche
Nouveauté: Cellules 293T dégelé par l’assistant de recherche Nouvelle boite « Production virale » contient les plasmides Solutions HBS et CaCl2 fabriquées maison


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