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HORMONES THYROIDIENNES Cours de formation continue présidé par Le Professeur N. Ben Rais Présenté par le Dr R.Ouboukdir Service de Médecine Nucléaire Hôpital.

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1 HORMONES THYROIDIENNES Cours de formation continue présidé par Le Professeur N. Ben Rais Présenté par le Dr R.Ouboukdir Service de Médecine Nucléaire Hôpital Ibn Sina

2 plan Introduction: Métabolisme des hormones thyroïdiennes: Effets biologiques: Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: Perturbations des dosages thyroïdiens d'origine médicamenteuse: Place des dosages de T4L et T3L dans le bilan thyroïdien fonctionnel: Conclusion:

3 Introduction La production hormonale de la glande thyroïde est composée de 80 % de la thyroxine (T4) et de 20 % de la tri-iodothyronine (T3). Dans le sérum lorigine de la T4 est uniquement thyroïdienne alors que 80 % de la T3 provient de la désiodation de la T4 en périphérie. Le dosage de la fraction libre de T4 (T4L) et de T3 (T3L) a supplanté celui des hormones totales (libres + liées) en raison dune meilleure sensibilité et spécificité diagnostiques. Le dosage des hormones totales a une place limitée en recherche ou en cas dhyperthyroïdie très sévère. Pour le dosage des hormones libres, la dialyse/RIA est la technique de référence actuelle. L'interprétation des bilans hormonaux thyroïdiens doit prendre en compte le type et la qualité du dosage effectué, les prises médicamenteuses et la pathologie sous jacente.

4 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Structure Biosynthèse Distribution et catabolisme Régulation de la biosynthèse Mécanismes d'action

5 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Structure des hormones thyroïdiennes Les hormones thyroïdiennes possèdent une même structure organique : la thyronine, formée par deux noyaux aromatiques reliés par un pont éther. Les hormones se différencient entre elles par le nombre et la place variables des atomes d'iode quelles portent.

6 Structure des hormones thyroïdiennes Métabolisme des hormones thyroïdiennes Structure des hormones thyroïdiennes Précurseurs tyrosine Liodation en 3 de la tyrosine donne la MIT Liodation en 3 et 5 de la tyrosine donne la DIT

7 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Structure des hormones thyroïdiennes Structure des hormones thyroïdiennes

8 Métabolisme des hormones thyroïdiennes La thyroglobuline a) Structure Il s'agit d'une glycoprotéine. C'est une très grosse molécule dimérique (PM= ) dont le monomère contient 2750 aminoacides. L'iode se fixe sur les résidus tyrosyls. b) Synthèse La synthèse de la thyroglobuline s'opère par assemblage successif d'acides aminés le long des ribosomes du réticulum endoplasmique. La captation d'acides aminés par les cellules thyroïdiennes est très active. L'adjonction des résidus glucidiques s'opère au stade final de la synthèse dans l'appareil de GOLGI. L'iodation des tyrosines se situe après assemblage de la molécule de thyroglobuline.

9 Schéma général Métabolisme des hormones thyroïdiennes Biosynthèse des hormones thyroïdiennes

10 Biosynthèse des hormones thyroïdiennes CYCLE DE L'IODE: Métabolisme des hormones thyroïdiennes Biosynthèse des hormones thyroïdiennes CYCLE DE L'IODE: Les entrées de l'iode se font surtout par voie digestive (apport alimentaire quotidien de 50 à 100 µg). L'iode est absorbé sous forme d'iodures I- par l'intestin grêle. Une absorption pulmonaire de vapeurs d'iode est également possible. L'iodure diffuse après absorption dans le plasma et les liquides extracellulaires où l'équilibre est atteint 4h après l'ingestion. L'épuration plasmatique de l'iodure s'effectue par la thyroïde et le rein :

11 Biosynthèse des hormones thyroïdiennes CYCLE DE L'IODE: Métabolisme des hormones thyroïdiennes Biosynthèse des hormones thyroïdiennes CYCLE DE L'IODE: Clairance thyroïdienne : ml/mn Clairance rénale : 30-40ml/mn A un degré moindre, l'iodure peut être fixé par : - les glandes salivaires - l'estomac - les glandes mammaires - les plexus choroïdes L'élimination s'effectue par les urines et pour une faible part dans les féces. L'élimination par le lait peut être importante chez la femme.

12 Biosynthèse des hormones thyroïdiennes Métabolisme des hormones thyroïdiennes Biosynthèse des hormones thyroïdiennes captation de liode Sa captation par la cellule thyroïdienne est liée au cotransport de sodium pour la traversée de la membrane basale et à l'existence de deux types de canaux anioniques pour le passage dans la colloïde. La captation d'iodure est stimulée par la TSH et inhibée par le brome,des anions comme le thiocyanate, SCN- le perchlorate, ClO4- et le pertechnectate. Il existe une autorégulation par l'iode lui-même. La captation est d'autant plus forte et plus prolongée que la glande est pauvre en iode et inversement

13 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Biosynthèse des hormones thyroïdiennes de l'iode Organification de l'iode La transformation de l'iode minéral apporté par l'alimentation puis capté par la thyroïde en iode organique immédiatement utilisable pour l'hormonosynthèse est sous la dépendance d'une peroxydase thyroïdienne 2I I 2 Il s'agit d'une enzyme spécifique liée à la membrane qui reconnaît 3 substrats : l'iode, la thyroglobuline et l'H 2 O 2 qui optimise son activité. La TSH accélère la vitesse d'organification de l'iode.

14 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Biosynthèse des hormones thyroïdiennes Fixation de l'iode sur les groupes tyrosyl de la thyroglobuline L'iode ainsi oxydé peut se lier aux résidus tyrosyl de la thyroglobuline (Tg), donnant naissance aux précurseurs des hormones thyroïdiennes : mono-iodo-tyrosine (MIT) et des di-iodo-tyrosine (DIT). Liodation de la Tg se fait au pôle apical, dans la substance colloïde.

15 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Biosynthèse des hormones thyroïdiennes Couplage-Stockage Un résidu de MIT et un résidu de DIT se combinent pour former la T3, et deux résidus de DIT pour former la T4 ou thyroxine, La thyroperoxydase intervient également dans le couplage des précurseurs. La thyroglobuline porteuse d'hormones thyroïdiennes est alors stockée dans la cavité colloïde (réserves thyroïdiennes en hormones pour environ deux mois,permettant de pallier aux variations des apports)

16 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Biosynthèse des hormones thyroïdiennes Libération la thyroglobuline passe dans la cellule épithéliale par microendocytose, hydrolysée par des enzymes protéolytiques libérant ainsi les hormones thyroïdiennes T3 et T4 qui sont ensuite sécrétées dans le plasma. La MIT et la DIT, ainsi libérées par hydrolyse de la thyroglobuline sont en grande partie désiodées dans la cellule épithéliale et l'iodure est récupéré pour une nouvelle synthèse hormonale. Une partie de la T3 libérée par les thyrocytes provient de la transformation de T4 en T3 sous l'influence de la 5'-désiodase.

17 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Distribution et catabolisme La T4 et la T3 circulent dans le sang sous deux formes en équilibre : lune libre et lautre liée à des protéines de transport. Chez un sujet euthyroïdien, seulement 0,02 % de la T4 est libre, le reste est lié : % à la thyroxine binding globulin (TBG), % à la préalbumine ou transthyrétine (TTR) 5-10 % à lalbumine. De même seulement 0,3 %de la T3 est libre, le reste est lié : %à la TBG, moins de 10 % à la TTR et environ 10 % à lalbumine

18 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Distribution et catabolisme La totalité de la T4 circulante provient de la production thyroïdienne, tandis que la plus grande partie de la T3 est issue de la conversion périphérique de T4 en T3

19 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Distribution et catabolisme La désiodation périphérique est le fait denzymes :la 5 désiodase qui permet la conversion de T4 en T3 et dont il existe deux types. La 5 désiodase de type 1, retrouvée dans le foie, le rein, la thyroïde et de nombreux autres tissus périphériques, est fortement modulée par l'état nutritionnel. La 5 désiodase de type 2 est présente dans le système nerveux central, l'hypophyse et la thyroïde. Son activité est majorée en cas d'hypothyroïdie de façon à couvrir les besoins du système nerveux central en hormones actives.

20 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Distribution et catabolisme la 5 désiodase transforme la T4 en T3 reverse, inactive. La dégradation des HT se fait au niveau du foie et du rein par diverses voies : conjugaison (puis excrétion biliaire), désamination et décarboxylation de la chaîne latérale alanine, désiodation périphérique,...

21 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Régulation de la biosynthèse l'axe thyréotrope. l'autorégulation thyroïdienne.

22 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Régulation de la biosynthèse l'axe thyréotrope. La TSH agit à différents niveaux : elle contrôle et stimule les différentes étapes de lhormono- synthèse: capture de l'iode, iodation de la thyroglobuline, pinocytose, hydrolyse de la thyroglobuline et sécrétion hormonale ; elle entretient le phénotype des thyrocytes en régulant l'expression et la synthèse de thyroglobuline, des pompes à iodures et de la thyroperoxydase ; enfin, la TSH est un facteur de croissance pour la thyroïde.

23 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Régulation de la biosynthèse Lautorégulation thyroïdienne correspond à des mécanismes transitoires permettant : -un blocage de liodation et de la sécrétion en cas d'excès d'iode (effet Wollf-Chaikoff) -une plus grande sensibilité des thyrocytes à l'action de la TSH en cas de carence en iode. - Enfin, la captation diode est d'autant plus forte et plus prolongée que la glande est pauvre en iode et Inversement

24 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Mécanismes d'action Après passage transmembranaire, (et éventuellement conversion deT4 en T3), les hormones thyroïdiennes vont agir à différents niveaux : - sites dactions nucléaires La T3 se lie à un récepteur cytosolique nucléotrope ; le complexe entre dans le noyau et participe à la régulation de l'expression génique ; - sites d'actions extra nucléaires

25 Métabolisme des hormones thyroïdiennes Mécanismes d'action La T3 exerce des actions membranaires avec un effet facilitateur du métabolisme cellulaire (potentialisation des récepteurs adrénergiques et des pompes ioniques, facilitation du passage de substrat énergétiques tels que le glucose et les acides aminés). Elle exerce également des effets au niveau de la mitochondrie avec augmentation de la calorigénèse et de la VO2.

26 Croissance et développement du squelette Pendant la période foetale, les hormones thyroïdiennes ne sont pas nécessaires à la croissance mais à la différenciation et à la maturation osseuse, leur absence saccompagnant dun retard dapparition des centres d'ossification épiphysaires (aspect dysgénésique). Durant la période postnatale, les HT deviennent indispensables à la croissance et continuent de contrôler la maturation et la différenciation osseuses. Effets biologiques:

27 Croissance et développement du squelette Les HT agissent en synergie avec l'hormone de croissance (GH). la GH favorise la chondrogénèse et la croissance du cartilage, tandis que les hormones thyroïdiennes permettent la maturation et l ossification du cartilage. En outre, elles favorisent la sécrétion de GH et potentialise les effets de lIGF-1. L'hypothyroïdie durant l'enfance aboutit à un nanisme dysharmonieux. Chez l'adulte l'hyperthyroïdie saccompagnant d'un risque d'ostéoporose.

28 Effets biologiques: Sur le système nerveux central leur rôle est primordial en particulier durant les premiers mois de vie. Elle participe aux mécanismes de maturation et de mise en place des connexions neuronale ainsi qu'à la myélinisation. Une carence durant cette période s'accompagne d'un retard mental pouvant être sévère (crétinisme). L'excès d'hormones thyroïdiennes est également délétère, la différenciation étant accélérée au détriment de la prolifération neuronale.

29 Effets biologiques: Sur le système nerveux central Chez l'adulte, les hormones thyroïdiennes participent également au fonctionnement du système nerveux central, hypothyroïdie pouvant s'accompagner d'un ralentissement et de somnolence, l'hyperthyroïdie étant caractérisée par une excitabilité et une irritabilité.

30 Effets biologiques: Effets métaboliques Métabolisme basal Les hormones thyroïdiennes augmentent la thermogenèse obligatoire et la VO2. Métabolisme glucidique Les hormones thyroïdiennes sont hyperglycémiantes (majorent l'absorption intestinale des glucides et favorisent la production hépatique de glucose ) Métabolisme lipidique Les HT augmentent la synthèse de cholestérol mais également sa dégradation hépatique En somme elles diminuent le taux du cholestérol

31 Effets biologiques: Effets métaboliques Métabolisme protéique Les hormones thyroïdiennes augmentent la synthèse protéique mais ont également un effet catabolisant, qui devient prépondérant à doses supra physiologiques. Métabolisme hydro minéral Les hormones thyroïdiennes augmentent la filtration glomérulaire et le débit sanguin rénal. L'hypothyroïdie s'accompagne ainsi doedème.

32 Effets biologiques: Effets tissulaires Au niveau cardiaque, les HT exercent un effet chronotrope positif et inotrope positif. Au niveau musculaire, les HT contrôlent la contraction et le métabolisme de la créatine. La carence en HT saccompagne dune augmentation de volume des muscles squelettiques (infiltrés par des substances mucoïdes). Lhyperthyroïdie saccompagne dune hyperexcitabilité musculaire et dune amyotrophie dans les formes sévères. (temps de demi relaxation ( 400 ms en cas d'hypothyroïdie) Sur le tube digestif, les hormones thyroïdiennes favorisent le transit. Les HT participent à la régulation de l'hématopoïèse et du métabolisme du fer, lhypothyroïdie saccompagnant dune anémie.

33 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Principes de base 1-Dosages avec un excès de réactif : méthodes immunométriques ou méthodes directes 1-Dosages avec un excès de réactif : méthodes immunométriques ou méthodes directes La totalité de l'antigène à doser se lie à l'anticorps fixé. Il est ensuite révélé par un anticorps marqué. On mesure la fraction liée qui augmente avec la concentration en antigène à doser

34 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Principes de base Dosages avec réactif limitant : méthodes par compétition ou méthodes indirectes L'antigène à doser entre en compétition avec l'antigène marqué pour la liaison à l'anticorps ; la totalité des sites anticorps disponibles est liée. On mesure la fraction liée qui diminue exponentiellement avec la concentration en Ag à doser. L'antigène à doser entre en compétition avec l'antigène marqué pour la liaison à l'anticorps ; la totalité des sites anticorps disponibles est liée. On mesure la fraction liée qui diminue exponentiellement avec la concentration en Ag à doser.

35 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Principes de base Les différents types de marquage présente lavantage de ne pas mettre en contact direct le ligand avec le sérum. Elle est, de ce fait, en principe à labri des interférences dues à des anomalies des protéines de transport ou à des anticorps anti-hormones thyroïdiennes Une seule incubation met en contact le sérum, le ligand et lanticorps Lanalogue dhormone entre en compétition avec les hormones libres pour un nombre limité de sites de liaison de lanticorps. Les enzymes les plus utilisées sont les phosphatases alcalines, glucose oxydase, glucose 6 phosphate déshydrogénase… L'enzyme (marqueur) est couplée à l'antigène (ou haptène) ou à l'anticorps. Ce couplage doit préserver : le site actif de l'enzyme le site de liaison Ag ou Ac

36 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Principes de base Les traceurs radioactifs - Dosages RIA : Actuellement, le marqueur radioactif le plus utilisé en immuno-analyse est l'Iode 125. En effet, ses caractéristiques physiques de période (60 jours) et de rayonnement (gamma de 35 keV) en font l'isotope de choix : utilisation des trousses pendant 4 à 8 semaines selon la vitesse de radiolyse du traceur (c'est-à-dire la rupture de la liaison entre l'anticorps ou l'antigène et l'Iode 125), rayonnement gamma donc détectable dans des compteurs à scintillation, mais d'énergie trop faible pour entraîner une irradiation externe du personnel. Les dosages RIA sont effectués par des méthodes manuelles ou semi-automatiques, rarement entièrement automatisées.

37 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Principes de base Les traceurs radioactifs - Dosages RIA : Détection du signal Les détecteurs sont composés dun scintillateur solide INa + photomultiplicateur. Les compteurs les plus utilisés sont de type multi puits,c.à.d composés de plusieurs sondes gamma. Photon gamma de 35kev Photon lumineux de 3ev La majorité de lénergie du photon gamma est déposé au niveau du cristal

38 PRÉCISION ET RENDEMENT DE COMPTAGE il y a un certain nombre de photon gamma qui ne provoquent pas une impulsion électrique ou qui en provoquent une impulsion plus faible: (cas des photons diffusés Compton qui seront éliminés du comptage par lanalyse spectrométrique qui ne retienne que les impulsions dont lamplitude dépasse une valeur seuil exploitant la propriété des photons diffusés dont lénergie est toujours inférieure à celle du photon incident). donc il ny a pas déquivalence absolue entre coups par minute (cpm) et désintégrations par minute (dpm). Pour connaître l'équivalence entre cpm et dpm, il faut faire un étalonnage de l'appareil. Le rendement de comptage sera le rapport cpm/dpm.

39 PRÉCISION ET RENDEMENT DE COMPTAGE Lerreur relative est inversement proportionnelle au racine carrée du nombre dévénement. Le nombre dévénement est proportionnel au temps de comptage. Donc lerreur relative est inversement proportionnelle au racine carrée du temps L'erreur relative diminue comme la racine carrée du temps de mesure. Pour diminuer cette erreur d'un facteur 2, il faut donc compter pendant un temps 4 fois plus long.

40 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones totales: La T4T et la T3T sont en général dosées dans le sérum à laide dimmunodosages compétitifs utilisant des marqueurs isotopiques, enzymatiques ou luminescents et des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Le 8-aniline-naphtalène-sulfonique acide (ANS) ou les salicylates sont utilisés pour dissocier les hormones thyroïdiennes des protéines de liaison.

41 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones totales: Un biais négatif, suite à une dissociation incomplète, peut apparaître quand la concentration protéique est élevée. Les anticorps anti-T4 ou anti-T3 peuvent fausser le résultat respectivement de T4T ou T3T, vers le haut ou vers le bas en fonction de la spécificité de la méthode de séparation employée dans le dosage. Lhormonémie totale présente linconvénient de dépendre de la concentration en protéines vectrices et de la liaison des hormones à ces protéines.

42 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones totales: Le dosage des hormones totales reste précieux pour suivre lefficacité du traitement dune hyperthyroïdie très sévère. En effet, dans cette situation, pendant plusieurs semaines la TSH peut rester abaissée et la concentration de T4L et T3L est supérieure à celle du dernier point de la gamme étalon. La dilution du sérum ne permet pas dobtenir la concentration réelle en hormones libres. Seule la quantification des hormones totales permet de suivre la baisse de la concentration des hormones thyroïdiennes et lefficacité du traitement jusquà ce que lhormonémie libre devienne mesurable.

43 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Étape pré analytique: La T4L et la T3L sont en général dosées dans le sérum. Le résultat nest pas influencé par une hémolyse modérée. La nature de lanticoagulant utilisé pour lobtention dun plasma doit être préalablement validée pour chaque méthode de dosage. Le sérum est stable 8 jours à 4 °C et doit être congelé à – 20 °C au-delà. Cependant chez les patients traités à lhéparine le sérum ne sera pas conservé plus de 24 heures à 4 °C.

44 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Méthodes de référence: Ces méthodes nécessitent la séparation physique de lhormone libre par dialyse à léquilibre ou ultrafiltration. Dans le dialysat ou lultrafiltrat, la T4 ou la T3 est dosée directement par une méthode radio-immunologique (RIA) très sensible

45 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Méthodes de référence: Dosage faisant appel à une séparation physique. Les dosages de T4 libre qui isolent les hormones libres de celles liées avant un dosage immunologique sensible sont standardisés par lutilisation de solutions de T4 préparées par gravimétrie.gravimétrie La séparation physique des hormones libres de celles liées est accomplie, soit avec une membrane semi -perméable qui utilise une chambre de dialyse selon une technique dultrafiltration, soit avec une colonne de résine dadsorption Sephadex. Une méthode extrêmement sensible de dosage de T4 par RIA est nécessaire pour mesurer les concentrations picomolaires de T4 libre dans les dialysats ou la fraction libre isolée,

46 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Immunodosages de routine: ces méthodes ont en commun une réaction directe du sérum avec un anticorps monoclonal ou polyclonal anti- hormone. Cet anticorps séquestre une fraction de lhormone. Ces techniques de dosage mettent en jeu un ligand qui entre en compétition avec lhormone pour la fixation sur les sites anticorps. Un marqueur radioactif (RIA), enzymatique (EIA) ou luminescent (LIA) est fixé sur le ligand ou lanticorps. Elles se différencient par la façon de quantifier loccupation des sites anticorps.

47 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Immunodosages de routine: Dosages en deux étapes Dans une première étape dincubation, ces méthodes utilisent un anticorps anti-hormone avec une affinité élevée (> 10exp11 mol/L) lié à un support solide (tube,particules ou Sephadex ultrafin) pour séquestrer une petite proportion dhormone totale dun échantillon de sérum dilué. Après une courte période dincubation, les éléments non liés sont éliminés avant la deuxième étape dans laquelle une quantité suffisante dhormone marquée est ajoutée pour se lier aux sites inoccupés de lanticorps. Après lavage, la quantité dhormone marquée liée à lanticorps fixé à la phase solide est quantifiée grâce à des standards gravimétriques ou de calibrateurs qui ont des valeurs dhormones libres définies par une méthode de référence

48 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Immunodosages de routine: Dosages en une étape: Une seule incubation met en contact le sérum, le ligand et lanticorps. Pour assurer la validité de ces dosages, le ligand doit conserver sa réactivité vis-à-vis de lanticorps sans interagir avec les protéines de liaison. Ce ligand peut dune façon générale être considéré comme un analogue de lhormone avec laquelle il doit conserver une certaine parenté structurale. Le marqueur est porté soit par le ligand, soit par lanticorps.

49 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Immunodosages de routine: Dosages en une étape: Méthodes par analogues dhormones (ligand) marqués: La validité physico-chimique des méthodes en une étape par analogues marqués dhormones était dépendante du développement dun analogue possédant une structure moléculaire totalement non réactive avec les protéines sériques, mais pouvant se lier aux sites inoccupés de lanticorps anti- hormone. lanalogue, qui est chimiquement associé à un signal tel quun isotope ou une enzyme, peut entrer en compétition avec les hormones libres pour un nombre limité de sites de liaison de lanticorps Cependant, il a été établi que leur exactitude diagnostique était faible en présence de concentrations anormales dalbumine, concentrations élevées dacides gras libres ou d'auto-anticorps anti-hormones thyroïdiennes.

50 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Immunodosages de routine: Dosages en une étape: Méthodes par anticorps marqués Cette méthode repose lutilisation en phase solide de complexes hormone/protéine non marqués (ligand) ne réagissant pas de manière significative avec les protéines sériques, pour quantifier les sites de liaison inoccupés de lanticorps anti-hormone dans la phase liquide. les différences physico-chimiques dues à la liaison danalogues au support solide saccompagnent de différences cinétiques qui résultent en une diminution de laffinité des analogues pour les protéines liantes endogènes et ainsi en un dosage de lhormone libre plus fiable.

51 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Méthodes par calcul de lindex dhormone libre : IT4L et IT3L Les méthodes dindex sont des estimations des hormones libres qui exigent deux dosages séparés : un dosage des hormones totales (T4T ou T3T) et une évaluation de la concentration des protéines de liaison des hormones thyroïdiennes utilisant un test immunologique pour la TBG, ou un test dadsorption de la T4 ou de la T3 appelé rapport de liaison des hormones thyroïdiennes (THBR pour thyroid hormone binding ratio).

52 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Index qui utilisent un ratio de liaison des hormones thyroïdiennes (THBR) ou test de capture (ou de transfert). Les tests dadsorption Les tests classiques dadsorption ajoutent une trace de T3 ou de T4 radio-marquée à léchantillon et permettent à lhormone marquée de se répartir entre les protéines de liaison de la thyroxine exactement de la même manière que les hormones endogènes. Comme seulement une trace de T3 ou de T4 marquée est utilisée, léquilibre initial est à peine modifié. La distribution du traceur dépend de la saturation des protéines liantes. Laddition dun liant secondaire ou adsorbant (résine déchangeuse danions, talc, éponge de polyuréthane, charbon de bois, ou des billes enrobées, etc.) conduit à une redistribution du traceur de T3 ou de T4 dans un nouvel équilibre qui inclut alors le liant. La quantité de traceur séquestrée par ladsorbant dépend de la saturation des protéines liantes : elle est proportionnelle au degré de saturation des protéines liantes. La fixation du traceur par ladsorbant mime un dosage indirect de TBG. Pour une concentration de TBG basse, les sites de liaison de la TBG sont fortement saturés en T4 de telle sorte quune plus petite quantité de T3 traceur se liera à la TBG et davantage capté par ladsorbant. Inversement, quand la concentration de TBG est élevée, sa saturation de T4 est faible. Plus de traceurs occupent alors des sites inoccupés de la TBG, et moins se fixent à ladsorbant.

53 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Index qui utilisent un ratio de liaison des hormones thyroïdiennes (THBR) ou test de capture (ou de transfert). Les tests dadsorption Adsorber le lié Adsorber le libre

54 Techniques de dosage des hormones thyroïdiennes: TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Dosages des hormones libres Immunodosages de routine: Performances techniques Pour la T4L la limite de détection est < 2 pmol/L Pour la T3L la limite de détection est < 0,5 pmol/L Ces valeurs sont suffisantes pour lutilisation clinique de ces dosages. Le domaine de mesure peut être compris entre 60 et 130 pmol/L pour la T4L. 0,5 -40 pmol/L pour la T3L. Avec les immunodosages de routine, si le résultat de T4L ou T3L obtenu est au-delà du dernier étalon de la gamme détalonnage, un résultat exact ne pourra pas être obtenu par dilution. En effet, léquilibre initial entre hormone liée et hormone libre tend à se rétablir après dilution dans un tampon inerte.

55 Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: La mesure des concentrations dhormones libres est soumise à linfluence de facteurs susceptibles de modifier léquilibre libre - lié : dilution, pH, force ionique, nature du tampon et température (le dosage doit être fait à 37 °C). Des inhibiteurs de liaison (ou compétiteurs) peuvent éventuellement entrer en compétition avec les hormones thyroïdiennes pour la liaison aux protéines de transport. Parmi ces inhibiteurs figurent des médicaments tels que le furosémide, les salicylates et des anti-inflammatoires non stéroïdiens (diclofénac, fenclofénac).

56 Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: Réactions croisées réactivité hétéro-spécifique Les problèmes de réactivité hétéro-spécifique résultent de lincapacité de lanticorps de faire la différence entre lanalyte et une molécule structurellement apparentée. Linterférence de lacide tri-iodo-thyro-acétique dans le dosage de T3L est fréquente et peut constituer un piège dans la mesure où cette prise médicamenteuse nest pas toujours connue du médecin. Certains dosages de T3L peuvent croiser avec des antiinflammatoires non stéroïdiens.

57 Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: Influence de la Grossesse Laugmentation de la TBG sérique et les concentrations basses de lalbumine pendant la grossesse, provoquent des variations de dosage de T4L largement dépendantes de la méthode employée. Les méthodes dépendantes de lalbumine peuvent produire des valeurs de T4L basses chez jusquà 50 pour cent des patients et être inadéquates pour évaluer létat thyroïdien pendant la grossesse à cause du biais négatif dû à la diminution progressive de la concentration de lalbumine sérique au troisième trimestre. Inversement, les méthodes telles que la dialyse au moyen dun radio-isotope ont tendance à montrer un biais positif

58 Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: Enfants prématurés Un taux de thyroxine bas sans élévation de la TSH est souvent rencontré chez les enfants prématurés de moins de 28 semaines de gestation. il est possible que les différences entre méthodes de dosage de T4L risquent de compromettre la fiabilité de la détection dhypothyroxinémie chez le prématuré.

59 Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: Anomalies génétiques des protéines porteuses Les anomalies qualitatives des protéines de transport peuvent concerner la TBG ou la transthyrétine Le variant de lalbumine responsable de La dysalbuminémie familiale hyperthyroxinémique (FDH) se caractérise par la présence dans le sérum dune forme particulière dalbumine avec une affinité très élevée pour la thyroxine. Cette anomalie de lalbumine est la conséquence de mutations du codon 218 du gène de lalbumine aboutissant au remplacement de larginine par lhistidine ou la proline Dans la FDH, les valeurs de la T4T sérique et de lIT4L sont élevées. Certains tests de T4L donnent également des valeurs supra normales, alors que les dosages de la T3T, la T3L, la TSH et la T4L sériques, par dautres méthodes, y compris la dialyse à léquilibre, sont normaux.

60 Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: Auto-anticorps Le sérum de certains patients contient des auto-anticorps anti-hormones thyroïdiennes qui sont à lorigine dartéfacts méthodologiques dans les dosages dhormones totales ou libres. Les interférences dues aux anticorps dépendent du type de méthode. Le traceur T4 ou T3 lié aux anticorps endogènes est faussement classé comme lié par les méthodes par adsorption, ou libre par les méthodes à double anticorps, menant respectivement à des valeurs de T4T ou T3T sériques faussement élevées ou basses. Les traceurs analogues de T4 utilisés dans certaines méthodes de T4L peuvent se lier à ces auto-anticorps, donnant des résultats de T4L sérique faussement élevés. Des anticorps anti-phase solide interférant dans des méthodes dhormones libres à anticorps marqués ont même été décrits.

61 Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: Thyrotoxicose et hypothyroïdie Le rapport entre T4 libre et totale et T3 dans la thyrotoxicose est non linéaire. Dans les thyrotoxicoses sévères, les élévations de la T4T et de la T4L sont disproportionnées. Cette non linéarité reflète autant une baisse de la concentration de TBG qu'une saturation de la capacité de liaison de la TBG en dépit de laugmentation de la liaison à la TTR et à lalbumine. La situation réciproque existe dans les hypothyroïdies sévères avec une occupation réduite de toutes les protéines de liaison. Dans cette situation, un excès de sites de liaison inoccupés peut atténuer la réponse de la T4L au traitement. Cela suggère que chez un malade hypothyroïdien une dose initiale de charge de L-T4 est lapproche la plus rapide pour restaurer le taux de T4L à un niveau thérapeutique.

62 Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: Artéfacts induits par le traitement à lhéparine Il est bien connu quen présence dune concentration dalbumine normale, les concentrations dacides gras libres > 3mmol/L augmentent la T4L en déplaçant lhormone de la TBG. Le sérum de malades traités à lhéparine, y compris des préparations dhéparine de faible poids moléculaire, peut présenter des valeurs de T4L faussement élevées, suite à une activité in vitro de la lipase induite par lhéparine qui augmente les acides gras libres. Des niveaux de triglycérides sériques augmentés, des concentrations basses dalbumine sérique ou une incubation prolongée durant le dosage à 37°C peuvent accentuer ce problème. le prélèvement devra être effectué au minimum 10 heures après linjection de lhéparine et le sérum conservé moins de 24 heures à 4 °C avant dosage.

63 Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: Médicaments qui entrent en compétition avec la liaison des hormones thyroïdiennes Quelques agents thérapeutiques et diagnostiques tel que phénytoïne, carbamazépine ou furosémide peuvent, de manière compétitive, inhiber la liaison des hormones thyroïdiennes aux protéines sériques. Il s'ensuit donc une élévation de la T4 libre (+ T3 libre) mais cet effet est fugace, avec possibilité de manifestations de thyrotoxicose, et la diminution de la TSH qui en découle rétablit secondairement l'équilibre.

64 Interférences dans les dosages des hormones thyroïdiennes: Médicaments qui entrent en compétition avec la liaison des hormones thyroïdiennes Durant ladministration chronique de ces substances compétitives la clairance dhormones est augmentée. Cependant, le système rétablit un équilibre normal : le niveau de T4L se normalise aux dépens dune concentration de T4T abaissée. A ce stade, la suppression de la médication causera une chute initiale de T4L dès lors que plus de sites sur les protéines porteuses deviennent disponibles. Il sen suit un retour de la T4L à la normale

65 Perturbations des dosages thyroïdiens d'origine médicamenteuse Modification des protéines vectrices Les médicaments peuvent modifier la synthèse des protéines vectrices en l'augmentant (œstrogènes, opiacés, clofibrate et 5 fluoro-uracile), ou en la diminuant (androgènes et stéroïdes anabolisants, glucocorticoïdes à doses importantes). Il s'ensuit une modification du taux des hormones totales portant surtout sur T4 sans perturbation des fractions hormonales libres (T4 L et T3 L), ni de la TSH.

66 Perturbations des dosages thyroïdiens d'origine médicamenteuse Inhibition de la synthèse et de la sécrétion Les antithyroïdiens de synthèse sont administrés dans ce but. C'est le cas du Néomercazole (carbimazole), du Basdène (benzylthiouracil) et du PTU (propylthiouracil). Le PTU exerce également une action périphérique en inhibant la conversion de T4 en T3. L'iode, les produits de contraste et les médicaments iodés provoquent une inhibition de l'organification de l'iodure. Cet effet est transitoire avec un échappement qui se produit en quelques jours. Les dysthyroïdies iodo-induites sont cependant fréquentes, plus particulièrement lorsqu'il existe une pathologie thyroïdienne sous-jacente. Elles peuvent toutefois survenir sur un corps thyroïde sain. Il faut aussi mentionner le cotrimoxazole, le clomifène, le nitroprussiate de sodium et surtout le lithium qui, de plus, inhibe la protéolyse de la thyroglobuline iodée.

67 Perturbations des dosages thyroïdiens d'origine médicamenteuse Altération du métabolisme des hormones thyroïdiennes Inhibition de la conversion périphérique de T4 en T3 par inhibition de la 5' monodésiodase. C'est le fait des composés organiques iodés, du propranolol, des corticoïdes, de la clomipramine et souvent de l'amiodarone, réalisant un syndrome de T3 basse avec T4 élevée et TSH normale Les dysthyroïdies induites par l'amiodarone sont fréquentes et peuvent être dues à différents mécanismes (surcharge iodée, inhibition de la conversion de T4 en T3, analogie de structure) Elles sont difficiles à affirmer. En plus de l'élévation de la T4, il faut exiger une diminution de la TSH pour le diagnostic de l'hyperthyroïdie et à l'inverse une diminution de la T4 et une élévation de la TSH pour celui de l'hypothyroïdie.

68 Perturbations des dosages thyroïdiens d'origine médicamenteuse Accélération de la clairance métabolique par induction enzymatique Un anticomitial, la phénytoïne, par induction des enzymes microsomiales hépatiques oxydatives, induit une diminution de la T4 sans modification de T3 et de TSH (avec également une baisse de la rT3). Les autres anticomitiaux (phénobarbital, carbamazépine, primidone) ont un effet moindre, mais potentialisent ceux du précédent, tout comme la rifampicine.

69 Perturbations des dosages thyroïdiens d'origine médicamenteuse Perturbation du cycle entérohépatique Le catabolisme des hormones thyroïdiennes est fait de désaminations et de désiodations avec conjugaison et excrétion biliaire et fécale. L'excrétion fécale, s'accompagne d'une recirculation partielle de T4 et de T3. Celle ci peut être perturbée par la cholestyramine et la néomycine qui complexent les hormones thyroïdiennes avec une diminution modeste de T4 et T3. Ces substances sont à même de provoquer une augmentation des besoins en hormones des hypothyroïdiens substitués.

70 Perturbations des dosages thyroïdiens d'origine médicamenteuse Altération du transfert tissulaire des hormones thyroïdiennes Elle réalise à l'extrême un véritable syndrome acquis de résistance aux hormones thyroïdiennes : certains produits anesthésiques (di-ethyl-ether, halothane et isoflurane) ont un tel effet, avec une augmentation concomitante de T3, T4 et TSH mais sans manifestations d'hypothyroïdie du fait de leur action brève. Ces manifestations d'hypothyroïdie sont possibles avec d'autres médicaments agissant par compétition avec le récepteur nucléaire à T3: c'est le cas de la phénytoïne, au niveau hypophysaire et d'un métabolite de l'amiodarone, le des-ethyl-amiodarone, au niveau cardiaque.

71 Perturbations des dosages thyroïdiens d'origine médicamenteuse Medicament agissant par action sur la TSH L'inhibition de la TSH par les hormones thyroïdiennes administrées dans le traitement du cancer de la thyroïde est l'effet recherché. Mais cette inhibition peut aussi être le reflet d'un surdosage dans le cas du traitement substitutif des hypothyroïdies. La TSH est également inhibée par la dopamine et ses agonistes (L Dopa, bromocryptine, piribédil, lysergoline) par les anti-sérotonines (cypro-heptadine, méthysergide et méthergoline), la somatostatine, les corticoïdes et la phénytoïne. les antidopaminergiques (neuroleptiques, métoclopramide, sulpiride, tiapride, dompéridone) et des œstrogènes. par action compétitive au niveau du récepteur hypophysaire à T3, exerce un effet direct de stimulation de la TSH.

72 Place du dosage des hormones thyroïdiennes libres dans larbre décisionnel du diagnostic biologique dune hyperthyroïdie. Place des dosages de T4L et T3L dans le bilan thyroïdien fonctionnel

73 Place du dosage des hormones thyroïdiennes libres dans larbre décisionnel du diagnostic biologique dune hypothyroïdie. Place des dosages de T4L et T3L dans le bilan thyroïdien fonctionnel

74 Causes délévation ou dabaissement isolée des hormones libres

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77 Conclusion: Lors de linterprétation dun bilan thyroïdien, les résultats discordants doivent faire lobjet dune vérification en répétant le dosage avec une méthode différente peu dépendante des interférences telle : un dialyse/RIA Ultrafiltration/RIA, tout en recherchant des prises médicamenteuses et des pathologies sous jacentes. MERCI DE VOTRE ATTENTION

78 Gravimétrie Cette méthode consiste à déduire la concentration de la molécule à doser de la masse d'un précipité. Pour cela on ajoute à la solution dont on veut trouver la concentration, une autre solution qui provoque la formation d'un précipité. Ce précipité est recueilli par (filtration, centrifugation, décantation), séché et pesé. D'après le volume de la solution de départ, on en déduit la concentration de la solution de départ. la réaction doit être totale, pratiquement instantanée. Le précipité doit être purifié et ne doit pas subir de pertes importantes. RETOUR


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