Titre ENZYMOLOGIE.

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1 Titre ENZYMOLOGIE

2 Plan 3 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
3.1. Les facteurs physico-chimiques. * La température. * Le pH. * Influence de la concentration en enzyme. * Influence de la concentration en produit. 3.4. Effecteurs enzymatiques. * I.N.C. (non compétitive) * I.C. (compétitive) * I.A.C. (anti-compétitive) * Inhibition irréversible. * Activateur. * Activation zymogène / enzyme.

3 3.1.1 Température 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * La température. On le fera enTP 40°C t Pdt On effectue une série de cinétique à des températures croissantes. 50°C 60°C 30°C On devine une relation complexe. 10°C 80°C T Vi On trace Vi = f ( T ). T optimale L'élévation de la température augmente la vitesse des réactions L'élévation de la température dénature l’enzyme La présence de deux phases est caractéristique de deux phénomènes distincts. T maximale

4 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
3.1. Les facteurs physico-chimiques. * La température. PLAN 3.1.1 Température k: constante de vitesse T: température R: constante des gaz parfaits (= 8,315 J.K-1.mol-1 ) Ea: énergie d'activation 40°C t Pdt 50°C 60°C 30°C La loi d'Arrhénius exprime la relation entre la constante de vitesse d'une réaction et de la température. 10°C 80°C T Vi Elle ne quantifie pas la dénaturation de l'enzyme. T optimale L'élévation de la température augmente la vitesse des réactions L'élévation de la température dénature l’enzyme 1/T LnVi Ea = - a x R T maximale

5 3.1.2 pH pH 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
Vol d'acide ajouté 3.1.2 pH Le pH agit sur l'état d'ionisation des fonctions chimiques des chaînes latérales. 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. t Pdt pH 7 pH 6.5 * La température. pKa2 pH 6 * Le pH. pH 5,5 -COO- -NH2 pH 5 -COO- -NH3+ pH 4 Le pH agit sur la nature des liaisons de faible énergie formées. Par conséquent, il agit sur: -COOH -NH3+ la conformation de la protéine pKa1 les interactions avec le ligand - COOH COO-

6 3.1.2 pH suite 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
3.1. Les facteurs physico-chimiques. * Le pH. 3.1.2 pH suite t Pdt Le pH agit sur l'état d'ionisation des fonctions chimiques des chaînes latérales. pH 7 pH 6.5 pH 6 pH 5,5 Attention ! L'interprétation n'est pas si simple. Le pH agit sur : pH 5 pH 4 Les AA de contact. (interaction avec le ligand) pH Vi Il existe plein de variantes possibles. Les AA auxiliaires. (conformation du site actif) Les AA collaborateurs. (conformation de la protéine et du site actif?) pKa de la fonction impliquée dans site actif

7 3.1.2 pH suite 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
3.1. Les facteurs physico-chimiques. PLAN * Le pH. 3.1.2 pH suite Le pH agit sur l'état d'ionisation des fonctions chimiques des chaînes latérales. 2 AA impliqués dans le site actif D'autres situations sont envisageables Attention ! L'interprétation n'est pas si simple. Le pH agit sur : 2 AA impliqués dans le site actif Les AA de contact. (interaction avec le ligand) pH Vi Les AA auxiliaires. (conformation du site actif) plusieurs AA (collaborateurs) impliqués Les AA collaborateurs. (conformation de la protéine et du site actif?) pKa de la fonction impliquée dans site actif

8 3.2 C Ez 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. La simple logique permet de prévoir l’influence de la concentration en enzyme sur la vitesse de réaction. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * La température. * Le pH. WINNER * Influence de la concentration en enzyme.

9 PLAN 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. * Influence de la concentration en enzyme. 3.2 C Ez graphe [ E ] Vi En fait, ce n'est pas si simple ! V = k.[ E ] Le graphe est linéaire tant que S >> E Vm augmente Km constant Si la concentration enzymatique dépasse un certain seuil, les protéines précipitent et adieu la cinétique. Si la concentration enzymatique est voisine de S: Si la concentration en substrat est très faible par rapport à l’enzyme, la réaction est presque instantanée. On est en dessous du seuil de sensibilité des appareils On obtient une courbe type Michaélis.

10 On parlera d’inhibition compétitive.
PLAN 3.3 C pdt démo 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * La température. * Le pH. Plus la concentration en produit est importante, plus la probabilité que l’enzyme se fixe sur lui (et ne catalyse pas la réaction dans le « bon » sens) est importante. L’enzyme catalyse la réaction dans les deux sens. Elle reconnaît le produit comme le réactif (ce sont deux substrats). WINNER * Influence de la concentration en enzyme. On parlera d’inhibition compétitive. * Influence de la concentration en produit.

11 3.4.1 INC 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
Elle permet un « emboitage » optimale avec le substrat (ici un dipeptide possédant un AA aromatique) 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. On sent que ça ballotte ! Le site actif présente une conformation précise. Ca, c’est la version officielle. La théorie est simple, élégante, mais présente une bonne dose de mauvaise foi. 3.4. Effecteurs enzymatiques. Le substrat n’a aucune difficulté pour se fixer dans le site de reconnaissance. * I.N.C. L’activité catalytique devient plus difficile et, par conséquent, plus lente. Certaines molécules se fixent sur des sites spécifiques... ...et modifient la conformation de l’enzyme.

12 On a vu ce qu’il faut en penser !
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. PLAN 3.4. Effecteurs enzymatiques. 3.4.1 INC graphe * INC. Ce phénomène influence l’activité de l’enzyme par rapport à la concentration de substrat. L’activité de l’enzyme est moins efficace en présence d’inhibiteur. C’est logique ! 1/S 1/Vi E + INC Vm diminue E seule Km constant On a vu ce qu’il faut en penser !

13 3.4.2 IC 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
Un inhibiteur compétitif est une molécule qui ressemble au substrat (analogue de substrat). IC 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. Il est complémentaire du site actif mais ne subit pas la réaction. Il bloque le fonctionnement de l’enzyme. 3.4. Effecteurs enzymatiques. Si l’enzyme fixe le substrat, elle se comporte normalement: Vm normal * I.C. Si l’enzyme fixe l’I.C., elle est totalement bloquée: Vm = 0 TPCK N-tosyl-L-phénylalaniyl-chlorométhylcétone

14 3.4.2 IC 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. PLAN
3.4. Effecteurs enzymatiques. IC * I.C. L’activité globale de l’enzyme dépend de la proportion d’enzyme ayant fixé le substrat et l’inhibiteur. Elle dépend donc de la proportion entre les concentrations de substrat et d’inhibiteur. S infini, V normal Vm normal. Si [S] >> [IC] (S très grand): globalement le comportement de l’enzyme est normal. Si [S] > [IC] (S normal): globalement l’enzyme est ralentie. La probabilité qu’elle fixe S diminue. Km augmente. 1/S 1/Vi E + I.C. Vm constant E seule Km augmente

15 L’inhibiteur anti-compétitif se fixe exclusivement sur le complexe ES.
IAC 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. Ce qui est étonnant pour un inhibiteur ! L’I.A.C. bloque le substrat dans le site de reconnaissance. le complexe est plus stable. Km diminue. 3.4. Effecteurs enzymatiques. L’I.A.C. bloque la réaction. Vm diminue. * I.A.C. Là, c’est normal !

16 En ce moment, c’est la mode les troubles bipolaires !
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. PLAN 3.4. Effecteurs enzymatiques. IAC * I.A.C. 1/S 1/Vi E + I.A.C. Vm diminue E seule Km diminue En ce moment, c’est la mode les troubles bipolaires ! L’IAC est assez peu répandue. On l’observe cependant chez les enzymes à deux substrats. Un IC du premier peut jouer le rôle d’IAC pour le deuxième. L’ion lithium est un IAC de l’inositol-1-Phosphatase. Cela pourrait expliquer en partie son rôle dans le traitement des troubles bipolaires.

17 Il se fixe de façon covalente.
PLAN I irrev 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. Un inhibiteur irréversible se comporte comme un inhibiteur classique... sauf qu’il est irréversible. --S Iodoacétate Il se fixe de façon covalente. I-CH2-COO- Agent alkylant. Il réagit avec les fonctions réactives des sites actifs. di-isopropylfluorophosphate DIFP 3.4. Effecteurs enzymatiques. H3C H CH3 C H3C O CH O P = O H3C F Inhibiteur suicide. Ils sont reconnus comme des substrats. OH OHH * Inhibition irréversible. Inhibiteur des protéines métaboliques. Ce sont des IC dont la constante de dissociation est extrêmement faible (10-14 mol.L-1)

18 PLAN 3.4.5 Activ 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. WINNER 3.4. Effecteurs enzymatiques. Changement du site catalytique Vm augmente. E seule La fixation d'une molécule (activateur) sur un site spécifique induit un changement de conformation du site actif et améliore la catalyse de la réaction. 1/S 1/Vi Changement du site de reconnaissance Km constant (ou diminue ou augmente). * Activateur. Km constant E + activateur Vm augmente

19 S ---------------------------S S ---------------------------S
chymotrypsinogène inactif 3.5 maturation lumière Un grand nombre d’enzymes, en particulier les enzymes de dégradation (hydrolases), sont dangereuses pour l’intégrité des cellules qui les produisent. S --S S S S S S S S --S S S S S S S acinus exocytose du chymotrysinogène L’activation de la chymotrypsine se déroule dans la lumière de l’intestin sous l’action des enzymes de digestion. trypsine stockage Elles sont produites sous forme d’un précurseur inactif (pro-enzyme ou zymogène) qui est activé par clivage interne sur le lieu de dégradation. p-chymotrypsine actif S --S S S S S S S S --S S S S S S S granule de zymogène appareil de Golgi chymotrypsinogène recouvert d’une membrane chymotrypsine a-chymotrypsine actif * Activation zymogène / enzyme. S --S S S S S S S REG synthèse du chymotrypsinogène

20 plan 4 4 . Enzymes complexes. 4.1. Complexe multi-enzymatique.
* Pyruvate déshydrogénase. * Chaîne respiratoire. 4.2. Allostérie. * Manifestation de l’allostérie. * Intérêt physiologique de l’allostérie. * Contrôle de l’activité enzymatique.

21 4.1.1 * Pyruvate déshydrogénase. PLAN

22 4.1.2 * 4.1.2. Chaîne respiratoire. Complexe cytc oxydase Complexe
NADH-Q réductase Complexe QH2-cytc réductase

23 4.1.2 suite * 4.1.2. Chaîne respiratoire. Complexe FADH2-Q réductase
QH2-cytc réductase Complexe cytc oxydase

24 * Chaîne respiratoire. 4.1.2 fin PLAN

25 4.2.1 allost * 4.2.1. Manifestation de l’allostérie.
Certaines enzymes clés des voies métaboliques ne présentent pas de comportement Michaelien. Phosphofructokinase Cette différence est mise en évidence grâce à la relation: Vi = f ( S ) * Manifestation de l’allostérie. Agrandissement du début de la courbe (S petit)

26 4.2.1 suite * 4.2.1. Manifestation de l’allostérie. PLAN phase III
saturation 4.2.1 suite Modèle de Monod, Wyman et Changeux (1965) phase II Enzyme très efficace phase I Enzyme peu efficace forme R Km < Agrandissement du début de la courbe (S petit) forme T Km >

27 4.2.2 O2 O2 O2 * 4.2.2. Intérêt physiologique de l’allostérie. O2
Il existe plusieurs modèles d’allostéries avec changement de conformation simultané ou progressif… 4.2.2 O2 O2 L’hémoglobine est un transporteur d’oxygène au comportement allostérique. Ce n’est pas vraiment une enzyme (quoique...) mais c’est un bon modèle de fonctionnement allostérique. O2 * Intérêt physiologique de l’allostérie. La fixation du premier O2 sur l’hème induit un changement de conformation de l’ensemble des sous-unités (tendue > relâchée) O2 Forme relâchée (R) Forme tendue (T)

28 4.2.2 suite * 4.2.2. Intérêt physiologique de l’allostérie.
L’hémoglobine n’est pas l’unique transporteur de dioxygène de l’organisme. Hémoglobine. Myoglobine. tétramère a2b2 monomère allostérique michaëlien

29 L’hémoglobine fixe moins bien O2 que la myoglobine.
* Intérêt physiologique de l’allostérie. PLAN 4.2.2 fin Hémoglobine. Myoglobine. P tissulaire P alvéolaire L’hémoglobine fixe moins bien O2 que la myoglobine. allostérique michaëlien 15 g.L-1 70 g.L-1 L’hémoglobine est plus apte à échanger son O2 dans les conditions physiologiques. Domaine d’échange

30 4.2.3 * 4.2.3. Contrôle de l’activité enzymatique.
Cas de la phosphofructo kinase 4.2.3 ATP La glycolyse dépend du taux d’ATP hydrolyse Enzyme plus efficace: accélération du métabolisme (allure michaëlienne) ATP Niveau de référence ATP Manque d’ATP Excès d’ATP * Contrôle de l’activité enzymatique. production Enzyme moins efficace: ralentissement du métabolisme ATP

31 plan 5 5. Enzymes: outil de production. * 5.1. Instrument d’analyse.
* Immobilisation. 5.3. Biocapteur. * Nature et rôle des biocapteurs. plan 5 Montage. * Biorécepteur. 5. Enzymes: outil de production. * Electrode de Clark. Transducteur. * Electrode à CO2. * Types de transducteurs. * Caractéristiques. Spécificité. Sensibilité. Temps de réaction. Type d’électrode. Interférence.

32 5.1 dos Ez * 5.1. Instrument d’analyse.
Les enzymes ne sont pas le sujet d’étude. Elles font partie des réactifs permettant la révélation du substrat à doser. * Instrument d’analyse. Certaines parties n’ont qu’un intérêt pratique. Analysons les parties restantes. Cette partie indique l’intérêt du test. D’autres permettent de juger la qualité des résultats. Ce n’est pas notre propos aujourd’hui. C’est plutôt le domaine des ABM ! 5.1 dos Ez Tous les renseignements sont disponibles dans la fiche technique. Encore faut-il savoir l’utiliser !

33 51 dos Ez suite * 5.1. Instrument d’analyse.
Les enzymes ne sont pas le sujet d’étude. Elles font partie des réactifs permettant la révélation du substrat à doser. Analysons les parties restantes. 51 dos Ez suite triglycérides quinonéimine

34 5.1 dos Ez suite * 5.1. Instrument d’analyse.
Les enzymes ne sont pas le sujet d’étude. Elles font partie des réactifs permettant la révélation du substrat à doser. Analysons les parties restantes. Analysons les parties restantes. Conditions optimales pour l’enzyme. - pH - force ionique - substrat (coloration) - coenzyme (Mg2+) 5.1 dos Ez suite Milieu permettant la réaction: - enzymes - Co-Enzyme (ATP)

35 5.1 dos Ez fin * 5.1. Instrument d’analyse. PLAN Beer Lambert
Absét = e.Cét.l Abséch = e.Céch.l Absét = Cét Abséch C éch Céch = Cét x Abséch Absét Les enzymes ne sont pas le sujet d’étude. Elles font partie des réactifs permettant la révélation du substrat à doser. PLAN Sans commentaire. Analysons les parties restantes. Analysons les parties restantes. 5.1 dos Ez fin Le protocole. Pas trop compliqué? C = r x M La terminologie DO n’est plus valable depuis 1974 ! Il est obligatoire d’utiliser Abs. C.10-3= r x n C = r x M = r x n.103 n = M.10-3 1/0,875 = 1,114 on est bien avancé ! D’où vient cette valeur? Ca, c’est pour les flémards.

36 5.2 immobil * 5.2. Immobilisation. Inclusion dans l’alginate
par inclusion physique (confinement) * Immobilisation. Enzyme 5.2 immobil par d’autres techniques (membranes,...) Membrane de dialyse lors de la fabrication de fibres Alginate + Ca2+ par introduction dans des fibres creuses Inclusion dans l’alginate dans un gel Enzyme

37 par inclusion physique par fixation par des liaisons...
* Immobilisation. PLAN par inclusion physique (confinement) par fixation par des liaisons... dans un gel par introduction dans des fibres creuses lors de la fabrication de fibres par d’autres techniques (membranes,...) Enzyme support préexistant 5.2 immobil suite CHO (CH2)3 covalentes non covalentes agent bifonctionel (réticulant) échangeur cationique: carboxyméthyl cellulose support préexistant lors de la création du support protéine de charge (BSA) ioniques Van der Waals échangeur anionique: DEAE cellulose

38 5.3.1 rôle biocapt PLAN 5.3. Biocapteur.
système permettant une identification spécifique une identification qualitative et quantitative une réutilisation des enzymes 5.3. Biocapteur. * Nature et rôle des biocapteurs. 5.3.1 rôle biocapt Réduisent les interventions humaines. Suppriment les opérations de prélèvement et d’analyse. Permettent l’automatisation. Améliorent fiabilité dosages en continu suivi en ligne de plusieurs étapes d’un même processus

39 5.3.2.1 Montage S e- a+-----> a P + a+ signal électrique Ez
Principe de fonctionnement. S Montage signal électrique Ez électrodes e- a+-----> a * Biorécepteur. P + a+ BIORECEPTEUR TRANSDUCTEUR AMPLIFICATEUR

40 5.3.2.1 Biorécepteur PLAN Capteur à glucose glucose H2O2 FAD GOD 2.e-
Principe de fonctionnement. PLAN Capteur à glucose glucose H2O2 FAD FADH2 GOD Biorécepteur 2.e- signal électrique gluconolactone O2 acide gluconique

41 cathode (indicatrice) Ag+ + Cl- -----> AgCl
Electrode Clark signal électrique cathode (indicatrice) Pt anode (de référence) Ag / AgCl Electrode de Clark. O2 + e- + 4H+-----> 2 H2O Ag -----> Ag+ + e- Ag+ + Cl > AgCl électrolyte KCl e- H2O joint torique membrane hydrophobe (téflon ou polypropylène) PLAN O2

42 Electrode à CO2 CO2 PLAN * Electrode à CO2. H+ + HCO3-
électrode indicatrice pH électrode de référence au calomel électrolyte * Electrode à CO2. H+ + HCO3- CO2 + H2O -----> H2CO3 membrane hydrophobe perméable aux gaz CO2 PLAN

43 types transducteurs générateur µA mV PLAN capteur ampérométrique
Création d’un courant électrique (tension imposée). L’intensité de courant résultante est la somme des deux courants (générateur + électrodes) capteur ampérométrique générateur µA capteur potentiométrique * Types de transducteurs. mV électrode électrolyte PLAN

44 5.3.3.1 caract 5.3.3. Caractéristiques. 5.3.3.1. Spécificité.
Capteur est une enzyme -----> la reconnaissance de la molécule possède la spécificité enzymatique: -----> glucose dans mélange de sucres -----> énantiomère d'AA dans un mélange Temps de réaction. Il s’agit du temps nécessaire pour obtenir signal stable. En général il est de 15 s à 2 mn Sensibilité.

45 méthode potentiométrique méthode ampérométrique
Caractéristiques. caract méthode potentiométrique méthode ampérométrique zone de linéarité E (mV) C (mmol.L-1) I (mA) log C pente = sensibilité pente = sensibilité limite de détection limite de linéarité Sensibilité. sensibilité = DE / DC sensibilité = DI / Dlog C

46 5.3.3.4 caract 5.2.3. Caractéristiques. 5.2.3.4. Electrodes multiples.
Dosage unique ou multiple: -----> électrode permettant un seul type de substrat -----> électrode permettant dosages de plusieurs substrats (ou plusieurs produits) Dans ce cas, le système possède plusieurs sensibilités différentes. La sensibilité globale correspond à la sensibilité la plus faible (limitante). Interférences. Certaines molécules peuvent réagir avec les électrodes et fausser mesures. - métaux lourds - hypochlorite de Na+ - acide ascorbique etc...

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