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ENZYMOLOGIE. 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * 3.1.1. La température. * 3.1.2. Le pH. * 3.2.

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1 ENZYMOLOGIE

2 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Les facteurs physico-chimiques. * La température. * Le pH. * 3.2. Influence de la concentration en enzyme. * 3.3. Influence de la concentration en produit Effecteurs enzymatiques. * I.N.C. (non compétitive) * I.C. (compétitive) * Activateur. * 3.5. Activation zymogène / enzyme. * I.A.C. (anti-compétitive) * Inhibition irréversible.

3 t Pdt 10°C 30°C 50°C 40°C 60°C 80°C T Vi L'élévation de la température augmente la vitesse des réactions L'élévation de la température dénature lenzyme 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Les facteurs physico-chimiques. * La température. T optimale T maximale On effectue une série de cinétique à des températures croissantes. On le fera enTP On devine une relation complexe. On trace Vi = f ( T ). La présence de deux phases est caractéristique de deux phénomènes distincts.

4 t Pdt 10°C 30°C 50°C 40°C 60°C 80°C T Vi L'élévation de la température augmente la vitesse des réactions L'élévation de la température dénature lenzyme 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Les facteurs physico-chimiques. * La température. T optimale T maximale La loi d'Arrhénius exprime la relation entre la constante de vitesse d'une réaction et de la température. 1/T LnVi Ea = - a x R k: constante de vitesse T: température R: constante des gaz parfaits (= 8,315 J.K -1.mol -1 ) Ea: énergie d'activation Elle ne quantifie pas la dénaturation de l'enzyme. PLAN

5 t Pdt pH 5 pH 5,5 pH 6.5 pH 7 pH 6 pH 4 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Les facteurs physico-chimiques. * La température. * Le pH. Le pH agit sur l'état d'ionisation des fonctions chimiques des chaînes latérales. pH Vol d'acide ajouté -COOH -NH 3 + -COO - -NH 3 + -COO - -NH 2 Le pH agit sur la nature des liaisons de faible énergie formées. Par conséquent, il agit sur: la conformation de la protéine les interactions avec le ligand pKa1 pKa2 - COOH -COO -

6 t Pdt pH 5 pH 5,5 pH 6.5 pH 7 pH 6 pH 4 pH Vi pKa de la fonction impliquée dans site actif 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Les facteurs physico-chimiques. * Le pH. Le pH agit sur l'état d'ionisation des fonctions chimiques des chaînes latérales. Attention ! L'interprétation n'est pas si simple. Le pH agit sur : Les AA de contact. (interaction avec le ligand) Les AA auxiliaires. (conformation du site actif) Les AA collaborateurs. (conformation de la protéine et du site actif?) Il existe plein de variantes possibles.

7 pH Vi pKa de la fonction impliquée dans site actif PLAN 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Les facteurs physico-chimiques. * Le pH. Le pH agit sur l'état d'ionisation des fonctions chimiques des chaînes latérales. Attention ! L'interprétation n'est pas si simple. Le pH agit sur : Les AA de contact. (interaction avec le ligand) Les AA auxiliaires. (conformation du site actif) Les AA collaborateurs. (conformation de la protéine et du site actif?) D'autres situations sont envisageables 2 AA impliqués dans le site actif plusieurs AA (collaborateurs) impliqués

8 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Les facteurs physico-chimiques. * La température. * Le pH. * 3.2. Influence de la concentration en enzyme. La simple logique permet de prévoir linfluence de la concentration en enzyme sur la vitesse de réaction. WINNER

9 * 3.2. Influence de la concentration en enzyme. 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. [ E ] Vi V = k.[ E ] En fait, ce n'est pas si simple ! Le graphe est linéaire tant que S >> E Si la concentration en substrat est très faible par rapport à lenzyme, la réaction est presque instantanée. Si la concentration enzymatique dépasse un certain seuil, les protéines précipitent et adieu la cinétique. PLAN Vm augmente Km constant Si la concentration enzymatique est voisine de S: On obtient une courbe type Michaélis. On est en dessous du seuil de sensibilité des appareils

10 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Les facteurs physico-chimiques. * La température. * Le pH. * 3.2. Influence de la concentration en enzyme. * 3.3. Influence de la concentration en produit. Lenzyme catalyse la réaction dans les deux sens. Elle reconnaît le produit comme le réactif (ce sont deux substrats). On parlera dinhibition compétitive. PLAN

11 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Effecteurs enzymatiques. * I.N.C. Le site actif présente une conformation précise. Elle permet un « emboitage » optimale avec le substrat (ici un dipeptide possédant un AA aromatique) Certaines molécules se fixent sur des sites spécifiques......et modifient la conformation de lenzyme. On sent que ça ballotte ! Lactivité catalytique devient plus difficile et, par conséquent, plus lente. Le substrat na aucune difficulté pour se fixer dans le site de reconnaissance. Ca, cest la version officielle. La théorie est simple, élégante, mais présente une bonne dose de mauvaise foi.

12 1/S 1/Vi E + INCE seule Vm diminue Km constant PLAN 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Effecteurs enzymatiques. * INC. Ce phénomène influence lactivité de lenzyme par rapport à la concentration de substrat. Lactivité de lenzyme est moins efficace en présence dinhibiteur. Cest logique ! On a vu ce quil faut en penser !

13 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Effecteurs enzymatiques. * I.C. Un inhibiteur compétitif est une molécule qui ressemble au substrat (analogue de substrat). Il est complémentaire du site actif mais ne subit pas la réaction. Il bloque le fonctionnement de lenzyme. Si lenzyme fixe le substrat, elle se comporte normalement: Vm normal Si lenzyme fixe lI.C., elle est totalement bloquée: Vm = 0 TPCK N-tosyl-L-phénylalaniyl-chlorométhylcétone

14 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Effecteurs enzymatiques. * I.C. E + I.C.E seule Vm constant Km augmente PLAN Lactivité globale de lenzyme dépend de la proportion denzyme ayant fixé le substrat et linhibiteur. Elle dépend donc de la proportion entre les concentrations de substrat et dinhibiteur. Si [S] >> [IC] (S très grand): globalement le comportement de lenzyme est normal. Si [S] > [IC] (S normal): globalement lenzyme est ralentie. La probabilité quelle fixe S diminue. S infini, V normal Vm normal. 1/S 1/Vi Km augmente.

15 * I.A.C. 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Effecteurs enzymatiques. Linhibiteur anti-compétitif se fixe exclusivement sur le complexe ES. LI.A.C. bloque le substrat dans le site de reconnaissance. le complexe est plus stable. Km diminue. LI.A.C. bloque la réaction. Vm diminue. Ce qui est étonnant pour un inhibiteur ! Là, cest normal !

16 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Effecteurs enzymatiques. * I.A.C. E + I.A.C.E seule Vm diminue Km diminue PLAN 1/S 1/Vi LIAC est assez peu répandue. On lobserve cependant chez les enzymes à deux substrats. Un IC du premier peut jouer le rôle dIAC pour le deuxième. Lion lithium est un IAC de linositol-1- Phosphatase. Cela pourrait expliquer en partie son rôle dans le traitement des troubles bipolaires. En ce moment, cest la mode les troubles bipolaires !

17 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Effecteurs enzymatiques. Un inhibiteur irréversible se comporte comme un inhibiteur classique... sauf quil est irréversible. * Inhibition irréversible. Il se fixe de façon covalente. Agent alkylant. I-CH 2 -COO - Iodoacétate --S Inhibiteur suicide. Ils sont reconnus comme des substrats. Il réagit avec les fonctions réactives des sites actifs. Inhibiteur des protéines métaboliques. Ce sont des IC dont la constante de dissociation est extrêmement faible ( mol.L -1 ) H 3 C H CH 3 C H 3 C O CH O P = O H 3 C F OH H OHOH di-isopropylfluorophosphate DIFP PLAN

18 E seuleE + activateur Km constant 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique Effecteurs enzymatiques. * Activateur. 1/S 1/Vi Changement du site catalytique Vm augmente. Changement du site de reconnaissance Km constant (ou diminue ou augmente). La fixation d'une molécule (activateur) sur un site spécifique induit un changement de conformation du site actif et améliore la catalyse de la réaction. Vm augmente WINNER PLAN

19 acinus REG appareil de Golgi granule de zymogène lumière synthèse du chymotrypsinogène stockage exocytose du chymotrysinogène chymotrypsinogène recouvert dune membrane S --S S S S SS S S --S S S S SS S S --S S S S SS S S --S S S S SS S S --S S S S SS S chymotrypsinogène inactif -chymotrypsine actif -chymotrypsine actif trypsine chymotrypsine * 3.5. Activation zymogène / enzyme. Un grand nombre denzymes, en particulier les enzymes de dégradation (hydrolases), sont dangereuses pour lintégrité des cellules qui les produisent. Elles sont produites sous forme dun précurseur inactif (pro- enzyme ou zymogène) qui est activé par clivage interne sur le lieu de dégradation. Lactivation de la chymotrypsine se déroule dans la lumière de lintestin sous laction des enzymes de digestion.

20 plan 4 4. Enzymes complexes Complexe multi-enzymatique. * Chaîne respiratoire Allostérie. * Manifestation de lallostérie. * Intérêt physiologique de lallostérie. * Contrôle de lactivité enzymatique. * Pyruvate déshydrogénase.

21 4.1.1 * Pyruvate déshydrogénase. PLAN

22 4.1.2 Complexe NADH-Q réductase Complexe QH 2 -cytc réductase Complexe cytc oxydase * Chaîne respiratoire.

23 4.1.2 suite Complexe FADH 2 -Q réductase Complexe QH 2 -cytc réductase Complexe cytc oxydase * Chaîne respiratoire.

24 4.1.2 fin * Chaîne respiratoire. PLAN

25 4.2.1 allost Certaines enzymes clés des voies métaboliques ne présentent pas de comportement Michaelien. Cette différence est mise en évidence grâce à la relation: Vi = f ( S ) Agrandissement du début de la courbe (S petit) * Manifestation de lallostérie. Phosphofructokinase

26 phase I Enzyme peu efficace phase II Enzyme très efficace phase III saturation forme T Km > forme R Km < PLAN * Manifestation de lallostérie. Modèle de Monod, Wyman et Changeux (1965)

27 O2O2 Lhémoglobine est un transporteur doxygène au comportement allostérique. Ce nest pas vraiment une enzyme (quoique...) mais cest un bon modèle de fonctionnement allostérique. Forme tendue (T) O2O2 Forme relâchée (R) O2O2 O2O2 * Intérêt physiologique de lallostérie. La fixation du premier O 2 sur lhème induit un changement de conformation de lensemble des sous-unités (tendue > relâchée) Il existe plusieurs modèles dallostéries avec changement de conformation simultané ou progressif…

28 4.2.2 suite * Intérêt physiologique de lallostérie. Lhémoglobine nest pas lunique transporteur de dioxygène de lorganisme. Hémoglobine.Myoglobine. tétramère monomère allostériquemichaëlien

29 4.2.2 fin Domaine déchange 70 g.L g.L -1 PLAN allostériquemichaëlien * Intérêt physiologique de lallostérie. Lhémoglobine fixe moins bien O 2 que la myoglobine. Lhémoglobine est plus apte à échanger son O 2 dans les conditions physiologiques. P tissulaireP alvéolaire Hémoglobine.Myoglobine.

30 4.2.3 Cas de la phosphofructo kinase ATP La glycolyse dépend du taux dATP Niveau de référence Excès dATP Enzyme moins efficace: ralentissement du métabolisme Manque dATP Enzyme plus efficace: accélération du métabolisme (allure michaëlienne) * Contrôle de lactivité enzymatique. hydrolyse production

31 * 5.2. Immobilisation Biocapteur. * Nature et rôle des biocapteurs Montage. * Biorécepteur Transducteur. * Caractéristiques Spécificité Sensibilité Temps de réaction Type délectrode Interférence. * Electrode de Clark. * Electrode à CO 2. * Types de transducteurs. 5. Enzymes: outil de production. * 5.1. Instrument danalyse.

32 Les enzymes ne sont pas le sujet détude. Elles font partie des réactifs permettant la révélation du substrat à doser. * 5.1. Instrument danalyse. Tous les renseignements sont disponibles dans la fiche technique. Encore faut-il savoir lutiliser ! Cette partie indique lintérêt du test. Cest plutôt le domaine des ABM ! Certaines parties nont quun intérêt pratique. Dautres permettent de juger la qualité des résultats. Ce nest pas notre propos aujourdhui. Analysons les parties restantes.

33 Les enzymes ne sont pas le sujet détude. Elles font partie des réactifs permettant la révélation du substrat à doser. * 5.1. Instrument danalyse. Analysons les parties restantes. triglycérides quinonéimine

34 Les enzymes ne sont pas le sujet détude. Elles font partie des réactifs permettant la révélation du substrat à doser. Analysons les parties restantes. Conditions optimales pour lenzyme. - pH - force ionique - substrat ( coloration ) - coenzyme (Mg 2+ ) Milieu permettant la réaction: - enzymes - Co-Enzyme (ATP) * 5.1. Instrument danalyse.

35 Les enzymes ne sont pas le sujet détude. Elles font partie des réactifs permettant la révélation du substrat à doser. Analysons les parties restantes. Sans commentaire. Le protocole. Pas trop compliqué? Ca, cest pour les flémards. La terminologie DO nest plus valable depuis 1974 ! Il est obligatoire dutiliser Abs. 1/0,875 = 1,114 on est bien avancé ! C = x M C = x n C = x M = x n.10 3 n = M Doù vient cette valeur? PLAN Beer Lambert Abs ét =.C ét.l Abs éch =.C éch.l Abs ét = C ét Abs éch C éch C éch = C ét x Abs éch Abs ét

36 5.2 immobil * 5.2. Immobilisation. par inclusion physique (confinement) dans un gel par introduction dans des fibres creuses lors de la fabrication de fibres par dautres techniques (membranes,...) Inclusion dans lalginate Alginate + Ca 2+ Enzyme Membrane de dialyse

37 5.2 immobil suite * 5.2. Immobilisation. par inclusion physique (confinement) par fixation par des liaisons... covalentesnon covalentes support préexistant lors de la création du support ioniquesVan der Waals support préexistant Enzyme protéine de charge (BSA) CHO (CH 2 ) 3 CHO agent bifonctionel (réticulant) échangeur anionique: DEAE cellulose échangeur cationique: carboxyméthyl cellulose PLAN

38 5.3.1 rôle biocapt 5.3. Biocapteur. * Nature et rôle des biocapteurs. système permettant une identification spécifique une réutilisation des enzymes une identification qualitative et quantitative Suppriment les opérations de prélèvement et danalyse. Réduisent les interventions humaines. Permettent lautomatisation. Améliorent fiabilité dosages en continusuivi en ligne de plusieurs étapes dun même processus PLAN

39 Montage BIORECEPTEUR Ez S P + a + TRANSDUCTEUR électrodes e- a > a signal électrique AMPLIFICATEUR * Biorécepteur. Principe de fonctionnement.

40 Biorécepteur Capteur à glucose glucose gluconolactone acide gluconique FAD FADH 2 O2O2 H2O2H2O2 GOD 2.e - signal électrique PLAN * Biorécepteur.Principe de fonctionnement.

41 Electrode Clark membrane hydrophobe (téflon ou polypropylène) joint torique anode (de référence) Ag / AgCl Ag -----> Ag + + e - Ag + + Cl > AgCl cathode (indicatrice) Pt O 2 + e - + 4H > 2 H 2 O O2O2 électrolyte KCl e- H2OH2O signal électrique PLAN Electrode de Clark.

42 Electrode à CO2 membrane hydrophobe perméable aux gaz CO 2 CO 2 + H 2 O -----> H 2 CO 3 H + + HCO 3 - électrode indicatrice pHélectrode de référence au calomel électrolyte PLAN * Electrode à CO 2.

43 types transducteurs mV capteur potentiométrique générateur capteur ampérométrique µA PLAN * Types de transducteurs. électrolyte électrode Création dun courant électrique (tension imposée). Lintensité de courant résultante est la somme des deux courants (générateur + électrodes)

44 caract Spécificité. Capteur est une enzyme -----> la reconnaissance de la molécule possède la spécificité enzymatique: -----> glucose dans mélange de sucres -----> énantiomère d'AA dans un mélange Sensibilité Temps de réaction. Il sagit du temps nécessaire pour obtenir signal stable. En général il est de 15 s à 2 mn Caractéristiques.

45 caract E (mV) C ( mmol.L -1 ) méthode potentiométrique zone de linéarité limite de détection pente = sensibilité sensibilité = E / C méthode ampérométrique sensibilité = I / log C limite de linéarité Caractéristiques. I (mA) log C pente = sensibilité Sensibilité.

46 caract Caractéristiques Electrodes multiples. Dosage unique ou multiple: -----> électrode permettant un seul type de substrat -----> électrode permettant dosages de plusieurs substrats (ou plusieurs produits) Dans ce cas, le système possède plusieurs sensibilités différentes. La sensibilité globale correspond à la sensibilité la plus faible (limitante) Interférences. Certaines molécules peuvent réagir avec les électrodes et fausser mesures. - métaux lourds - hypochlorite de Na+ - acide ascorbique etc...

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