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La culture de cellules animales, quosse ça donne? Alain Garnier, Université Laval.

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1 La culture de cellules animales, quosse ça donne? Alain Garnier, Université Laval

2 Plan La culture de cellules animales: –Quest-ce? –Pourquoi? –Comment?

3 Quest-ce? Différentes sources Différents types techniques de transformation Caractéristiques générales

4 Sources Insectes Poissons Mammifères Humains

5 Formes/tissus Épithéliales/endothéliales (membranes) Fibroblastes (tissus connectifs) Myoblastes (muscles) Neurones (syst. nerveux) Hepatocytes (foie) Erythrocytes (sang) Lymphocytes (syst. immunitaire)

6 Formes...

7 Types Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent dêtre prélevées dun tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC). Culture secondaire: Propagation dune culture primaire. Création dune lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée de vie limitée (30-50 divisions). Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.

8 Transformations Naturelles Chimiques Virales Dirigées

9 Différentes lignées MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhérentes, vaccins HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension, versatile Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système dexpression baculovirus 293: embryon de rein humain, transformée par fragment dadénovirus, stable, hôte dadénovirus, adaptée à la suspension (293S)

10 Exemple: lhistorique de la mise en culture des 293 Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977

11 Caractéristiques générales Capable dexocytose Ne sécrète pas denzymes Modifications post-traductionnelles Introns/épissage (splicing) Besoins nutritionnels complexes Grande taille (10-20 m), pas de paroi Sensible au contraintes hydrodynamiques Temps de division lent (approx. 1 jour) Densité cellulaire faible

12 Modification post-traductionnelle Clivage Pont S méthylation, phosphorylation, glycosylation conformation ajout de ligands spécifiques (lipid anchor)

13 Glycosylation

14 Introns/Exons, Epissage (splicing)

15 Pourquoi? Pour létude Pour la production: –Vaccins –Protéines thérapeutiques anticorps agents immunologiques Hormones –Tissus –Vecteurs viraux –Cellules souches

16 34% des nouveaux médicaments sont produits en culture de cellules de mammifères % de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)

17 Les anticorps Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de polypeptides, lune de 25kD (chaîne courte, domaine variable), lautre de 50 kDa (chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de lanticorps pour son antigène

18 Production danticorps monoclonaux MAb

19 Anticorps monoclonaux - applications 37% des nouvelles molécules thérapeutiques biologiques Identification/diagnostic Thérapeutique: –Contre cancer, Crohn, Asthme, SIDA, etc. –Dirigés contre une protéine spécifique, ils peuvent bloquer une interaction récepteur-ligand ou déclencher une réponse immunitaire. –Ils peuvent aussi être liés à un agent chemothérapeutique, radioactif ou autre pour augmenter leur effet.

20 Autres protéines Erythropoïétine (EPO, traitement de lanémie) Hormones de croissance: –Transforming Growth Factor (TGF) –Epidermal Growth Factor (EGF) –Nerve Growth Factor (NGF) Anovulants Cytokines (Interleukine, interféron, etc) Agents coagulants (Facteur viii), anti- coagulants, etc

21 Interleukin 4

22 Exemple: Agent anti-angiogénétique (Laboratoires Aeterna) Le processus de langiogénèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de laileron de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans des cellules animales.

23 Influenza HerpesAdenovirus Production de vaccins

24 Thérapie génique

25 Maladies traitées

26 Vecteurs utilisés Adénovirus Rétrovirus La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche.

27 Culture de tissus Cellules de peau (Hopital du Saint- Sacrement, Laboratoire d'organogénèse expérimentale) Reconstruction de la moëlle épinière (Organogel inc.) Organes (foie, cœur, cerveau, etc) Cellules souches

28 Comment? Caractéristiques générales –Capable dexocytose –Ne sécrète pas denzymes –Modifications post-traductionnelles –Introns/épissage (splicing) –Besoins nutritionnels complexes –Grande taille (10-20 m), pas de paroi –Sensible au contraintes hydrodynamiques –Temps de division lent (approx. 1 jour) –Densité cellulaire faible

29 Exemple de milieu de culture: Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM) Sels (mg/L) –CaCl –Fe(NO 3 ) 3.9H 2 O0.10 –KCl –MgSO –NaCl –NaHCO –NaH 2 PO 4.H 2 O Acides aminés (mg/L) –Arginine84.00 –Cystine.2HCl63.00 –Glutamine –Glycine30.00 –Histidine42.00 –Isoleucine –Leucine –Lysine.HCl –Méthionine30.00 –Phenylalanine66.00 –Sérine mélange d'additifs non-définis –Méthionine30.00 –Phenylalanine66.00 –Serine42.00 –Thréonine95.00 –Tryptophane16.00 –Tyrosine.2Na.2H 2 O –Valine94.00 Vitamines (mg/L) –Ca.pantothénate4.00 –Chlorure de choline4.00 –Acide folique4.00 –Inositol7.20 –Niacinamide4.00 –Riboflavine0.40 –Thiamine.HCl4.00 –Pyridoxine.HCl4.00 Autres (mg/L) –Glucose –Rouge de phénol15.00 –Na.Pyruvate110.00

30 Sensibilité aux contraintes hydrodynamiques = problème doxygénation ou dagitation Pourtant les besoins en O2 des cellules animales ne sont pas si élevés

31 Les cellules animales ne supportent que de très petites contraintes hydrodynamiques, ce qui fait en sorte que toutes sorte dindice de sévérité de lagitation on été proposés: Integrated Shear Factor (Sinskey) Taille du plus petit tourbillon (Théorie de Kolmogoroff) Vitesse du plus petit tourbillon TCS: Turbulent collision severity (Cherry et Papoutsakis) ICS: Impeller collision severity Concentration en plus petit tourbillon

32 Plusieurs géométries de bioréacteurs ont été proposées: différentes formes dagitateur –marine –ruban hélicoïdal –«voiles» gazosyphon lits fluidisés transfert de gaz par tube de silicone enrichissement en oxygène

33 Agitateur «voiles» Lit fluidisé

34 Division lente, faible densité Facilement contaminable –une bactérie prendra facilement le dessus –Nécessite des conditions d'asepsie très strictes Faible rendement en produit –produit à haute valeur ajoutée –produit qui ne peut être synthétisé dans dautres systèmes d expression –Recherche de moyens pour augmenter la densité cellulaire...

35 Au niveau cellulaire: le mécanisme de débordement -Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: , 1994 (Hybridoma) GLUCOSE PYRUVATE TCA cycle, resp. chain lactate glucose pyruvate GLUTAMINE GLUTAMATE OU glutamine NH 3 glutamate

36 Au niveau du procédé Loptimisation du milieu prend du temps, mais permet de faire de grandes économies La cuvée alimentée peut permettre daugmenter la densité cellulaire dans le cas dun substrat inhibiteur ou dun produit inhibiteur dont la production dépend de la concentration en substrat. Le chemostat ou la perfusion vont permettre une augmentation de la densité cellulaire et de la productivité, mais avec un coût plus élevé en milieu de culture

37 Au niveau du bioréacteur –Microporteurs (poreux ou non) –Micro-capsules –Fibres creuses –Rétention des cellules (perfusion): Spin-filters (intra ou extra bioréacteur) centrifugeuse en continu Sonosep

38 Microporteurs

39 Exemple: Un filtre rotatif intra- bioréacteur, combiné à un aérateur

40 Fibres creuses

41 Centrifugeuse en continu

42 Sonosep: séparation acoustique Entrée Sortie Vidange

43 Conclusion La culture de cellules animales est coûteuse et complexe. Elle ne doit être utilisée que pour produire des molécules qui ne peuvent être obtenues autrement. Elle permet alors de synthétiser des produits à très haute valeur ajoutée


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