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Régulation génétique par les petits ARN non- codants Christophe ANTONIEWSKI Institut Pasteur « Génétique de la souris » 27 janvier.

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1 Régulation génétique par les petits ARN non- codants Christophe ANTONIEWSKI Institut Pasteur « Génétique de la souris » 27 janvier (1h30)

2 Découverte de linterférence par lARN

3 Injection transfection Inverted-repeattranscription Viruses Exogenous Endogenous feeding Homology dependent Cosuppression ARN double-brin Post Trancriptional Gene Silencing (dégradation de lARNm de séquence homologue) Interférence par lARN

4 S2 Extract Luc dsRNA* Elbashir et al. Genes & Development (2001) 15: ère partie: siRNA (small interfering RNA) DicerImmunoprecipitation Cyc dsRNA* Bernstein et al. Nature (2001) 409: 363

5 19 nucléotides double-brin 2 nucléotides débordants en 3(OH) Activité RNAi per se Activité séquence-spécifique Ciblent ARN sens et antisens 2-O-Met (in vivo) Caractéristiques des siRNA (O-Met-2) (2-O-Met)

6 Le complexe RISC (RNA Induced Silencing Complex) Argonautes AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires Piwi, Aubergine, AGO-3: Lignée Germinale AGO-1, AGO-2 : ubiquitaires Piwi, Aubergine, AGO-3: Lignée Germinale Deux groupes de protéines selon la présence daa conservés N- term: Williams RW, Rubin GM PNAS 2002

7

8 RNA Induced Silencing Complex RISC mRNA degradation Cleavage and release of the "passenger" strand Helicase ? (Armitage/sde3) R2D2 se fixe à l'extrémité la + stable Recrutant Dcr à l'extrémité la - stable R2D2 "reconnaît" le 5'P du brin "passager" G G

9 2ème partie: les microRNA Lin-14, lin28Lin-41, hbl1 lin-4 3 UTR CDS lin14

10 Ordres de grandeur Genome miRNA identifiés expérimentalement C. elegans D. melanogaster M. musculus H. sapiens ~150 ~700

11 Structure des gènes des miRNAs - primary miRNA (pri- miRNA) miRNA autonomes miRNA "passager s" ~50% Pri-miRNA : « Cappés » Queue Poly-A Pol II-dépendants Rare

12 Pri-miRNA --> Pré-miRNA Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006

13 Pri-miRNA --> Pré-miRNA : le complexe « microprocessor » Han et al. Cell 125, 887–901, June 2, 2006Seitz and Zamore Cell 125, p827, June 2, 2006

14 Biogenèse des miRNA Mais quelle Argonaute ? G Biais 5U G RISC 1

15 « specialized » miRNA and siRNA pathways in Drosophila

16 Répression traductionnelle Vs clivage Saxena et al JBC 2003

17 La séquence « graine » (seed) Dur de trouver une cible de miRNA ! Stark et al Plos Biol 2004 Doench et al G&D 2004

18 Les miRNA agissent aussi en déstabilisant les mRNA cibles miR124 fortement exprimé dans le cerveau Transfection de miR 124 dans des cellules Hela miR124 fortement exprimé dans le cerveau Transfection de miR 124 dans des cellules Hela Lim et al. (2005) NATURE VOL 433, p gènes réprimés (Niveau ARN)

19 Modèles daction des miRNA Eulalio et al, Cell 2008

20 Fonction des miRNAs au cours du développement Adapted from Alvarez-Garcia and Miska, Development 2005

21 miRNA et Cancers Amplified in B Cell lymphoma miR17 cMyc target + regulates E2F1 Trangenic mice overexpression miR17 harbor c-myc-induced lymphomas They target Bcl2, upregulated in many types of cancers Classification of human cancers using miRNA profiling Lu et al (2005). Nature 435, 834

22 3ème partie: les piRNA Bergman et al. Genome Biology 2006, 7:R112 Aravin et al. Developmental Cell (2003), Vol. 5, 337– paires de bases Biaisés en 5: U (80% des cas) 2-O-méthylés à l'extrémité 3 Correspondent majoritairement à des éléments transposables (transposons et rétrotransposons) rasiRNA surtout abondants dans la lignée germinale (ovaires et testicules)

23 Co-immunoprécipitation par anti-Piwi À partir dextraits dovaires Clonage/séquençage des petits RNA associés Saito et al., Genes and Dev (2006) Les piRNAs représentent 80% des petits ARN coprécipités avec un Anti-Piwi Il correspondent bien à des éléments répétés du génome (rasiRNA). piRNAs

24 Saito et al., Genes and Dev (2006) Les piRNA sont majoritairement « antisens »

25 Vagin et al., Science (2006) La voie classique RNA-i est sans effet sur le contrôle des rétroéléments Pas de contrôle par dcr1 sur mdg1, roo et mst40: la voie miRNA est également sans effet Dans la lignée germinale, les piRNA répriment lexpression des Elements Transposables Les acteurs importants pour le silencing des rétroéléments sont Piwi, Aubergine, armi, et Spn-E (Homeless)

26 Séquençage direct de molécules uniques Pyroséquençage « » From Margulies, M., et al. (2005). Nature 437, Solexa, Solid, Helico… 10 à 100 millions de lectures, de ~ 50 nt

27 Pyroséquençage… Et la lumière fut !

28 Origine génomique des loci producteurs de piRNA

29 Biogenèse et mécanisme daction des piRNA chez la drosophile

30 Deep sequencing of Ago2-associated small RNAs

31 Biogenèse des endo-siRNA: 3 type de loci producteurs Les éléments répétés, transposons et rétrotransposons Les zones de recouvrement des 3 UTR (gènes convergents) Des ARN non-codants « structurés »

32 Endo-siRNAs silence transposable element in the soma (as do piRNAs in the germ line)

33 Regulation of gene expression Regulation of gene expression Transposon repression Heterochromatin formation Transposon repression Heterochromatin formation Defense against viruses Transposon repression Heterochromatin formation Defense against viruses Transposon repression Heterochromatin formation

34 Mathieu Bartoletti Bassam Berry Corinne Besnard-Guerin Anne-Laure Bougé Caroline Jacquier Josette Pidoux Edwige Seguy Hélène Thomassin


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