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TECHNIQUES Principes et applications. Culture de Tetrahymena Données de base Température optimale: 28 °C Température minimale: environ 12-14 °C Température.

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1 TECHNIQUES Principes et applications

2 Culture de Tetrahymena Données de base Température optimale: 28 °C Température minimale: environ °C Température maximale: environ °C (choc thermique réversible) Temps de génération: 2h30-4h15 (normalement 4h)

3 Culture de Tetrahymena Milieux de culture Culture axénique: sans autres micro- organismes Milieu semi-défini Source acides aminés: hydrolysat de protéine Protéose, peptone, tryptone, lait Source de vitamines: extrait de levure Glucose Sels: peu concentrés, maintien du pH Na ou K, H 2 PO 3 2-

4 Culture de Tetrahymena Culture stock Température basse: 14°C Milieu pauvre Pas de source de vitamines ou glucose Peptone peu concentrée => Doit utiliser beaucoup dénergie/temps pour synthétiser vitamines et autres Croissance lente Repiquage moins fréquent

5 Culture de Tetrahymena Culture de conditionnement Température presque optimale: 25°C Milieu riche source de vitamines ou glucose hydrolysats plus concentrées et variés Réadaptation progressive à des conditions de croissance rapide

6 Culture de Tetrahymena Culture de croissance Température optimale: 28°C Milieu riche source de vitamines ou glucose hydrolysats plus concentrées et variés Agitation: meilleure oxygénation Conditions de croissance rapide Obtention de grandes quantités de cellules

7 Culture de Tetrahymena Culture massive Température optimale: 28°C Milieu très riche source de vitamines et glucose lait comme source d'acides aminés Agitation: meilleure oxygénation Conditions de croissance rapide Obtention de très grandes quantités de cellules

8 Culture de Tetrahymena Culture en milieu défini Milieu défini: [ ] exactes de toutes les composantes individuelles sont connues Température optimale: 28°C Milieu Acides aminés Vitamines Glucose Autres éléments (ac. gras, minéraux….) => Connaissance et contrôle des conditions

9 Culture de Tetrahymena Milieu minimal Tris 10 mM + pH Glucose Milieu simple pour incorporation acides aminés marqués Pas de croissance Court terme "choc" => induisant une réponse ????

10 Tetrahymena Concentration des cellules Dispositif de concentration Certaines manipulations requièrent des concentrations de cellules non obtenues par des cultures de croissance Si on a besoin de concentrer les cellules

11 Tetrahymena Concentration des cellules Lang et Gauthier (1993)

12 Tetrahymena Enumération à l'hémacymètre Détermination du nombre de cellules Hémacymètre Normalement destiné à l'énumération des cellules du sang 2 cotés et 5 zones par coté 10 zones = 1 µL Lamelle spéciale (coûteuse) Cellules immobilisées (formaldéhyde) Cellules cotés: supérieurs et gauches

13 s/hemarefpf.html

14 Tetrahymena Traitements Exposition à choc thermique ou toxique Cellules concentrées/diluées pour obtenir conc. finale voulue Tubes contenant le milieu de culture (selon volume final voulu) +toxique concentré --> conc. finale voulue au temps = 0 +cellules concentrées --> conc. finale voulue +N.p.o.: contrôle: volume identique dans chaque tube +1 tube sans produit toxique: solvant du toxique

15 Traitements Incuber à T° voulue Prélever aliquotes aux temps voulus --> µtubes (1.5 ou 2 mL) Centrifuger > 10 kRPM x 10 min --> sédiment = cell. Extraire les cell. en resuspendant dans soln voulue §SDS --> électro.

16 Electrophorèse (EGPA) Séparation des protéines par EGPA-SDS Protéines dénaturées: SDS et ßME + chauffage Charge uniforme + géométrie similaire séparation selon masse Système triphasique Tampon d'électrode: glycine Gel de tassement: Cl - pH 6.8 (conc. PA faible) Gel de séparation: Cl - pH8.8 (conc. PA forte) ==> échantillons volumineux peuvent être compactés pour donner une résolution supérieure

17 Electrophorese Principe de la séparation

18 Electrophorèse Analyse des protéines synthétisées Electrophorèse Tassement Séparation Fixation et Coloration Ac. Acétique 10% Bleu de Comassie (simple et sensible) Argent (complexe mais très sensible) Buvardage ou Séchage + conservation

19 Buvardage principes Transférer à la surface d'une matrice solide Différentes matrices: nitrocellulose… PVDF, nylon. Capacité d'adsorption Buvardage: transfert électrophorétique Adsorption: forces hydrophobes, ioniques Méthanol. porosité de la matrice, durée et puissance du transfert

20 Transfert western mécanisme

21 Immunodétection Identification et détection d'une protéine spécifique Anticorps spécifique à la protéine d'intérêt Adsorption antigène d'intérêt sur la matrice Buvardage électrophorétique Application directe ("dot blot")

22 Immunodétection précautions Blocage des sites inoccupés Protéines: lait en poudre, albumine, collagene (gélatine) => Ne contient pas antigène, anticorps, enzyme indicateur Prévention des liaisons non spécifiques détergent doux: Tween (empêche adsorption Ag-Ab et Ab-marice non spécifique)

23 Immunodétection Adsorption de l'anticorps sur l'antigène (primaire) Adsorption de l'anticorps secondaire conjugué avec enzyme sur l'antigène primaire (autres marqueurs fluorochromes) Détection de l'enzyme: Chromogénique Chemiluminescent Radioactif, fluorescent, etc.

24 Immunodétection: enzymes Phosphatase alcaline Sensible Bon contraste en photo Stable Peroxydase de raifort (HRP) Assez sensible Durée limitée incubation (H 2 O 2 ) Coloration +/- stable (H 2 O 2 ) Contraste moyen

25 Electro ou Immunodétection Comparer des patrons de migration Déposer même quantité de protéines ou protéines provenant d'une même quantité de cellules = difficile Base de comparaison: étalon interne Protéine qui reste en quantité stable dans une cellule Étalons courants: actine, GAP

26 Immunodétection

27 Marquage métabolique des protéines Souvent on doit être capable de distinguer les protéines dont la synthèse est induite/ralentie par le traitement => Marquage métabolique: Exposition des cellules a des ac. Aminés marqués Extraction et séparation des protéines Autoradio- ou fluorographie


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