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Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010.

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1 Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

2 Cinétique et stochiométrie  Définition  Les termes de base  Les modes d’opération  Les relations de base  Détermination théorique  Détermination expérimentale – Taux initiaux – Cuvée – Chemostat – Stop flow

3 Croissance cellulaire - variables XSP Taux de variation (kg/(m 3.s) dX/dtdS/dtdP/dt Taux de production /consommation rxrx rsrs rprp Taux spécifique (kg/(kg.s)  = r x /X q s= -r s /Xq p= r P /X Rendement (kg/kg)Y x/s = r x /r s =  /q p Yp/x, Yp/s

4 Mode d’opération  Système fermé: cuvée (batch) •Aucune entrée ou sortie •Régime transitoire •dX/dt = r X, dS/dt = r S •À t = 0, X = X 0, S = S 0

5 Cuvée alimentée (Fed-batch) •Alimentation seulement •Régime transitoire •À t = 0, V= V 0, X= X 0, S= S 0 •F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S 0 =S c •Si S est constant,  le sera aussi,  =  c F(t), S in V, X, S

6 Chemostat (continu, CSTR) F, S in V, X, S, P F, S, X, P •Une entrée, une sortie •Mélange idéal: X out = X, S out = S, P out = P •Après une période initiale d’adaptation, ce système atteindra un régime permanent: V= cst, X= cst, S= cst, P= cst

7 Chemostat avec recirculation F F(1+w) V, X Bioréacteur Décanteur F(1+w) wF, X x F c, X c F ex, X x •Permet de concentrer les cellules dans le bioréacteur •Permet de repousser le lavage •Développement pour X seulement

8 Croissance cellulaire –type de modèles STRUCTURÉ/ SÉGRÉGÉ NON- STRUCTURÉ STRUCTURÉ NON- SÉGRÉGÉ + simple SÉGRÉGÉ Structuré: Tient compte de métabolites intra-cellulaires Ségrégé: Tient compte d’une distribution de population

9 Modèles de croissance  Du plus simple au plus compliqué – Exponentiel (ordre 0!!) – Linéaire (logistique) – Monod – Autres  Phénomènes connexes – Maintenance – Mortalité  Production – Luedeking-Piret combiné aux différents modèles

10 Modèle enzymatique - Monod -Une variable indépendante, 3 variables dépendantes, trois équations = Une solution! (1) (2) (3) -Pour un système fermé (cuvée) en supposant Y X/S constant:

11 Modèle de Monod  Équation 3 n’est peut- être pas nécessaire: Xmax-X = Yx/s * S Alors:

12 Modèle de Monod

13 Sachant que:

14 Modèle de Monod S = (Xmax-X)/Yx/s Données  max= 1 Ks=5 Yx/s=0,5 So=20 Xo=0,1

15 Détermination théorique  Cinétique…  Rendement: modèles structurés (stochiométriques et autres)

16 Une vue très simplifiée du métabolisme cellulaire [C 6 H 12 O 6 ] n C 6 H 12 O 6 G3P glycerol purines pyruvateAcétyl-CoA lactate Acides gras éthanol Lipides Ac.aminéspyrimidines Cycle de Krebs Acides nucléiques protéines NAD+ ATP H2O NADH ADP O 2 Chaîne respiratoire Le catabolisme génère de l’ATP et du NADH Modèle stochiométrique (cliquez ici)

17 Autres valeurs du coefficient de rendement (Bailey&Ollis, McGraw-Hill, 1986)

18 Détermination expérimentale  Coefficient de rendement  Cinétique – Taux initiaux – Stop-flow – Cuvée – Chemostat

19 Détermination expérimentale du coefficient de rendement - Y X/S constant S = (Xmax-X)/Yx/s Données  max= 1 Ks=5 Yx/s=0,5 So=20 Xo=0,1

20 Estimation des rendements en cuvée Avec des données de t, X, S, on peut calculer, Yx/s par un graphe de X vs S: Ici, Yx/s = 0,5

21 Effet de maintenance   S =  S(croissance) +  S(maintenance)  r S = 1/Y G * r X + m * X  q s = 1/Y G *  + m  1/Y x/s = q s /  1/Y G + m/ 

22 Effet de maintenance  1/Y x/s = q s /  1/Y G + m/ 

23 Effet de mortalité  Le taux de mortalité cellulaire: r d = - k d *X où k d =cste  Donc en cuvée: dX/dt =  *X – k d *X = (  – k d )*X En général, on néglige la maintenance et la mortalité en cuvée

24 Mécanisme de débordement: effet sur la cinétique et le rendement glutamine -Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: , 1994 (Hybridoma) GLUCOSE PYRUVATE TCA cycle, resp. chain lactate glucose pyruvate GLUTAMINE GLUTAMATE OU NH 3 glutamate

25 Détermination de la cinétique – Taux initiaux Évaluation de qglc, qgln, qlact et qNH3

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28 Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux arrêté (Stopped-flow): Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs qui seront mélangés. Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation par la seringue « stop ».

29 Systèmes d’analyse de cinétique rapide Moteur Mélangeur Lumière Détection Moteur Temps mort : Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange) Temps mort : Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange) De l’ordre de 1 milliseconde. Réactif 1 Réactif 2

30 Les composés seront analysés par des méthodes spectrophotométriques à l’aide de : Systèmes d’analyse de cinétique rapide  Photodiodes  Dichroïsme circulaire  Tube photomultiplicateur  Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5 millisecondes)  Photodiodes  Dichroïsme circulaire  Tube photomultiplicateur  Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5 millisecondes)

31 Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux étanché (Quenched-flow) : Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et des intermédiaires. Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges et les analyser.

32 Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux étanché (Quenched-flow) : Types d’étanchage :  Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1M)  Étanchage physique : Congélation ultra-rapide. Types d’étanchage :  Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1M)  Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.

33 Moteur Mélangeur Moteur Mélangeur Récupération des fractions Systèmes d’analyse de cinétique rapide Délai réactionnel de l’ordre de 2 à 100 millisecondes Chambre réactionnelle linéaire Réactif 1 Réactif 2 Agent étanchant

34  Spectroscopie de masse « en ligne »  Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse  Électrophorèse sur gel,  Comptage à scintillation,  etc…  Spectroscopie de masse « en ligne »  Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse  Électrophorèse sur gel,  Comptage à scintillation,  etc… Systèmes d’analyse de cinétique rapide Les fractions recueillies sont analysées par des méthodes non-optiques :

35 Estimation des paramètres de Monod en cuvée  Puis on peut reformuler l’équation de X pour isoler des termes reliés linéairement: ÷t Y = b + m X

36 Monod – estimation des paramètres  max = 1 m = 0,2475 = K s *Y x/s /X max K s = 0,2475*10,1/0,5 K s = 5

37 Utilisation du Chemostat pour la détermination des paramètres cinétiques  Relation cinétique, par exemple Monod:

38 Prochain labo: Cuvée alimentée (Fed-batch) •Alimentation seulement •Régime transitoire •À t = 0, V= V 0, X= X 0, S= S 0 •F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S 0 =S c •Si S est constant,  le sera aussi,  =  c F(t), S in V, X, S

39 Cuvée alimentée (Fed-batch)  3 bilans seront nécessaires pour obtenir un modèle de ce système: F ….

40 Cuvée alimentée (Fed-batch)

41 F0

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