HPLC & MS A. Garnier 19 novembre 2014 Intro: Tout est analytique

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1 HPLC & MS A. Garnier 19 novembre 2014 Intro: Tout est analytique
Brainstorm sur les moyens analytiques Conclusion sur l'intérêt de la combinaison de moyens de séparation et de mesure

2 Combinaison séparation+détection: SDS-PAGE
Figure 1: SDS-PAGE of FBS depleted by different matrices. 1) untreated FBS; Cibacron blue albumin depletion, flowthrough (FT, 2), eluate (E, 3); MEP IgG depletion, FT (4), E (5); immuno-affinity binding of the 12 most abundant human serum proteins, FT(6), E(7); new method, FT (8), E (9). Of all the tested methods, the new approach is the most able to separate the abundant proteins from the less abundant ones, to the point where a number of the later are observable in the E fraction (lane 9). This allow a far more effective fractionation of FBS which in turn allow a tremendous improvement in active fraction(s) identification. SDS-PAGE 4-12% A. Garnier lab result, Chem. Eng. dept, Université Laval

3 Séparation+détection: Électrophorèse 2-D
2-DE des protéines soluble de levures (Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)

4 Séparation + détection = chromatographie
Chromatographie en phase gazeuse Chromatographie sur papier buvard

5 Chromatographie gaz vs liquide

6 Chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC)
Échange d’ions Tamis moléculaire Interaction hydrophobe Phase inverse Électrophorèse Automatique Réfrigéré Échantilloneur Réservoir de Phase mobile Pompe Colonne Détecteur Échantillon Collecteur de fraction UV/visible Fluorescence Infra-rouge Indice de réfraction Conductivité Spectrométrie de masse En fonction de la colonne Gradient

7 Exemple de HPLC (Agilent 1100)

8 Différentes phases stationnaires
Phase mobile TP P NP NP P TP - +++ ++ + Normale (hydrophobe) Inverse (hydrophile) Exclusion de taille Ionique P: polaire

9 Exemple de chromatogramme

10 Caractéristique d'un pic chromatographique
tM tR tR' ω = 4 σ δ = 2,354 σ 2 σ Facteur de fixation: k = tR'/tM k = (tR-tM)/tM k = tR/tM - 1 Efficacité: N = (tR/σ)2 N = 16 (tR/ω)2 L/N=H Exemple: 2 colonnes de 25 cm, 1 et 2 tR1 = 416,4 - tR2 = 481,2 d1= 10,2s - d2= 13,2s Calculez N1, N2, H1, H2 identifiez la colonne la plus efficace

11 Résolution entre deux pics
Facteur de sélectivité: α = tB'/tA' = kB/kA α est constant pour des conditions données Résolution: RS = Δt/ω Pic A Pic B tA tB Δt tM ωA ωB Cliquer ici pour accéder au fichier Excel

12 Quantification en chromatographie

13 Spectroscopie de masse – secteur magnétique
Constitué de: une source d'ionisation un ou plusieurs analyseurs qui séparent les ions produits selon leur rapport m/z un détecteur qui compte les ions et amplifie le signal un système informatique pour traiter le signal

14 Spectrométrie de masse - quadrupole
m/z Précision :~m/z Vitesse de balayage: 5000 m/z par sec Le temps de vie d’un ion de sa formation a sa détection ~ μs.

15 Spectrométrie de masse – trappe ionique
Les ions sont capturés pour un certain intervalle de temps avant d’être soumis à l’analyse par un MS Concentre les ions pour obtenir une détection significative Sensible, peu dispendieux, mais faible précision massique (Aebersold et Mann, 2003)

16 Spectrométrie de masse - temps de vol (TOF)
Les ions sont accélérés dans un champ électrique et acquièrent ainsi une vélocité dépendante de leur masse. La mesure du temps nécessaire à l’ion (temps de vol) ainsi accéléré pour parcourir la distance le séparant du détecteur permet d’en déduire la masse

17 Spectrométrie de masse – résonance cyclotronique d’ion (FT-ICR)
En passant dans le champ B les ions subissent une mouvement circulaire perpendiculaire au champ B La force de rotation des ions est fonction de leur m/z Ils sont excités sur une orbite plus grande par induction d’un courant RF La détection des ions est basée sur une trace de courant que l’ion laisse lors de son passage entre deux électrodes. La fréquence de ce courant est la même que celle du courant RF et l’intensité du courant est proportionnel au nombre d’ions (Marshall et al., 1998) ;

18 Spectrométrie de masse – résonance cyclotronique d’ion (FT-ICR)
Une fréquence peut être mesurée plus précisément que toutes autres lectures expérimentales Avec seulement 100 ions d’un ratio m/z donné, le FT-ICR peut détecter un composé; détection de protéine jusqu’à des seuils de 450 amol (10-18)(Marshall et al., 1998) Coûteux (> 1M $) et volumineux Fichiers LC-MS requierent espace mémoire de plusieurs TB en mode continu

19 Chromatographie en phase gazeuse - spectroscopie de masse (GCMS)

20 Spectroscopie de masse – diagramme d’application

21 Chromatographie en phase liquide - spectroscopie de masse (LCMS)

22 Tout est dans l'interface LC-MS
L'electro-atomisation (electro-spray ionisation, ESI) John Fenn, prix Nobel de chimie, 2002

23 Tout est dans l'interface LC-MS
L'electro-atomisation (electro-spray ionisation, ESI) Mentionner la compatibilité de la phase mobile requise Stéphane Jacques, comédien dans "Mémoires vives"

24 Exemple d’analyse – myoglobine humaine
AN: P02144, séquence: MGLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKHPGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG 154 acides aminés MM = Da # R (Arg, pKa= 12,1) = 2 # K (Lys, pKa= 10,6) = 20 # H (His, pKa= 6,0) = 9 # E (glu, pKa= 4,2) = 14 # D (asp, pKa= 3,7) = 8 Informations obtenues sur UniProtKB

25 Exemple de résultat - myoglobine
Le résultat obtenu est un spectre de masse représentant les rapports m/z des ions détectés sur l'abscisse et l'abondance relative de ces ions sur l'ordonnée Le spectre est le résultat de la distribution de charges sur la population moléculaire Permet d'analyser qualitativement et quantitativement la protéine d'intérêt ΔMM = 233 ≈ 2 ac. aminés

26 Acides aminés La charge d'une protéine dans un LCMS sera à la fois fonction du voltage à l'interface et du pH de la phase mobile Le pH aura un effet sur la charge des acides aminés qui composent la protéine Le pKA des acides aminés sera affecté par la structure protéique Ce phénomène sera stochastique "Amino Acids" by Dancojocari -

27 Exemple de calcul de la distribution de charge
Séquence: AAAAHHHHAAAA On suppose un pKA commun = 6 (pour His) à un pH = 6 Chaque His a une probabilité de 50% d'être chargé Cliquer ici pour accéder au fichier Excel

28 Exemple de résultat - myoglobine
Le résultat obtenu est un spectre de masse représentant les rapports m/z des ions détectés sur l'abscisse et l'abondance relative de ces ions sur l'ordonnée Le spectre est le résultat de la distribution de charges sur la population moléculaire Permet d'analyser qualitativement et quantitativement la protéine d'intérêt ΔMM = 233 ≈ 2 ac. aminés Cliquer ici pour accéder au fichier Excel Cliquer ici pour un exemple de calcul des pKA via PROPKA

29 Exemple d'application de la LCMS pour le suivi d'un bioréacteur
Image 2D "tR-m/z d'une production de virus recombinant. Michaud et al., Appl Biochem Biotechnol, 167:474, 2012

30 Spectrométrie de masse en tandem (MSMS) – analyse de protéines
MS spectrum MS/MS ion spectrum m/z Dissociation nomenclature fragment proposée par Roepstorff, 1984 (Yates, 1998; Westermeier et Naven, 2002; Graves, 2002)

31 Spectrométrie de Masse, Analyseurs: Tandem MS (MS/MS)
MS/MS, 2 étapes : Détection et sélection d’un composé Décomposition en fragments fournissant de l’information structurelle. Cette fragmentation est effectuée par "Collision Induced Dissociation" (CID). MS/MS, 2 types de configurations : Analyseurs en séries (tandem dans l’espace) triples quadrupole, hybride quadrupole-TOF, Analyseurs employant les méthodes de trappes ionique (tandem en temps): quadrupole-trappe ionique (trappe ionique linéaire) ou directement un appareil de type FT-ICR (Westermeier et Naven, 2002).

32 Exemple d'analyse MSMS Albumine BSA, numéro d'accès P02769 sur UniProt
MM: 68kDa Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L), souvent utilisé en milieu de culture de cellules de mammifères

33 MS de BSA Michaud, Garnier, Lemieux, Duchesne, Proteomics, 9:512, 2009

34 Exemple d'analyse MSMS Albumine
>P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus (Bovine). MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA Number of amino acids: 594 Molecular weight: Theoretical pI: 5.77 Informations obtenues sur Expasy, outil PeptideMass:

35 Albumine: fragments trypsiques
position mass peptide sequence 25-28 500,2463 DTHK 1177,5591 ECCDKPLLEK 29-34 712,3736 SEIAHR 1015,4877 SHCIAEVEK 37-44 974,4577 DLGEEHFK 1955,9596 DAIPENLPPLTADFAEDK 45-65 2435,2427 GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK 752,3573 NYQEAK 66-75 1163,6306 LVNELTEFAK 1567,7427 DAFLGSFLYEYSR 76-88 1349,546 TCVADESHAGCEK 1283,7106 HPEYAVSVLLR 89-100 1362,6722 SLHTLFGDELCK 1388,5708 EYEATLEECCAK 545,3405 VASLR 1497,6314 DDPHACYSTVFDK 1364,4803 ETYGDMADCCEK 1305,7161 HLVDEPQNLIK 658,3155 QEPER 1011,42 QNCDQFEK 977,4509 NECFLSHK 1479,7954 LGEYGFQNALIVR 886,4152 DDSPDLPK 1511,8427 VPQVSTPTLVEVSR 1519,7461 LKPDPNTLCDEFK 1052,4499 CCTKPESER 537,282 FWGK 1667,8131 MPCTEDYLSLILNR 927,4934 YLYEIAR 841,46 LCVLHEK 1888,9268 HPYFYAPELLYYANK 660,3563 TPVSEK 1633,6621 YNGVFQECCQAEDK 1024,455 CCTESLVNR 701,4014 GACLLPK 1823,8996 RPCFSALTPDETYVPK 649,3338 IETMR 609,2878 AFDEK 703,4097 VLASSAR 1850,8993 LFTFHADICTLPDTEK CASIQK 1014,6193 QTALVELLK 508,2514 FGER 509,3194 HKPK 689,3729 AWSVAR 818,4254 ATEEQLK 922,488 AEFVEVTK 1399,6926 TVMENFVAFVDK 789,4716 LVTDLTK 725,2593 CCAADDK 1578,5981 ECCHGDLLECADDR 1050,4924 EACFAVEGPK 517,298 ADLAK 1002,583 LVVSTQTALA 1386,6206 YICDNQDTISSK La trypsine est une enzyme qui coupe les liaisons Lys-X ou Arg-X

36 Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique
ANALYSE MS2, cliquez ici Identification de protéine, cliquez ici (Logiciel Mascot, Matrix Science) Pour en savoir plus, suivez ce lien (cliquer ici)

37 Spectrométrie de Masse - quantification
Un problème majeur lors de l’analyse de peptide et/ou protéines en MS est la variation d’ionisation due à des paramètres non contrôlable. L’intensité du signal d’un peptide ne reflète pas directement la quantité de ce peptide (Lu et al., 2004) Solution: implémentation d’un standard interne; un isotope stable

38 Spectrométrie de Masse - ICAT
Isotope coded affinity tagging (ICAT) Réactif sous 2 formes réagissant avec les groupements thiol des cystéines des protéines permettant d’avoir un groupement d’isotopes sur les peptides Différence de 8 unités de masse entre l’échantillon vs un standard (Gygi et al., 1999) (Graves, 2002)

39 Spectrométrie de Masse - quantification: autres méthodes
ICAT: réactif coûteux (25$ /nmol) Se lie seulement aux cystéines des peptides (Goshe et Smith, 2003) SILAC: “stable isotope labeling by amino acids in cell culture” (0.2$ /nmol) (Ong et al., 2002) Autres méthodes: iTRAQ et AQUA

40 Protéomique du sérum sanguin
60 à 80 g/L de protéine (Tirumalai et al., 2003) protéines différentes 22 protéines = 99% de la quantité protéinique du sérum (Zhang et al., 2005) 12 log de variation de concentration (Anderson et Anderson, 2002; Zhang et al., 2005) Tirumalai et al., 2003

41 Protéomique du sérum sanguin
Anderson et Anderson, 2002