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Identification de facteurs impliqués dans la Mécanosensibilité colique. Alison Accarie / 1 er année de thèse Directeur de thèse : Pr. Michel Dapoigny Directeurs.

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1 Identification de facteurs impliqués dans la Mécanosensibilité colique. Alison Accarie / 1 er année de thèse Directeur de thèse : Pr. Michel Dapoigny Directeurs du laboratoire : Pr. Alain Eschalier et Pr. Denis Ardid UMR/INSERM 1107 Neuro Dol, Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la douleur

2 U1107 / Pharmacologie fondamentale et clinique de la douleur prise en charge insuffisante des douleurs chroniques Introduction Axe : Douleur viscérale Douleurs abdominales Première cause de consultation en gastroentérologie Symptôme commun au SII et MICI en période de rémission Douleurs coliques SII : syndrome intestin irritable MICI : maladie inflammatoire chroniques de lintestin

3 Introduction hypersensibilité colique Douleurs coliques 2/3 des cas réponse exacerbée à un stimulus douloureux ou non sensibilisation au niveau périphérique (organe cible) Probablement dorigine mécanique Compression dorganes (cancer) Distension (ballonnements)

4 Introduction mécanosensation colique : différents senseurs périphériques Intégration centrale

5 Introduction Mécanosensibilité colique : implication de canaux ioniques ASIC (Acid sensing ion channels) : sensible au pH TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) : sensible au chaud TRPA ( Transient Receptor Potential family A ): sensible au stretch, température et irritants Senseurs périphériques? Pas de rôle clair. Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010

6 Introduction Identification dun nouveau Facteur de Transcription dans cas de stimulation mécanique des tiges chez Arabidopsis & Popular sp. (Equipe MECA, UMR PIAF) PtaZFP2 Expression précoce Motif doigt de zinc Mécanosenseurs présents aussi chez les plantes, avec équivalent génique chez lanimal

7 Introduction Martin, 2009 Cinétique dexpression courte Induit pour une stimulation Phénomène de sensibilisation NGF1-C/egr-4 équivalent génique de PtaZFP2 chez la souris

8 Introduction Famille Egr : 4 sous types Facteur de transcription / Gène de réponse précoce Structure à doigt de zinc liaison à lADN Cys 2 -His 2 Modulation dexpression de gènes lors de la transmission nerveuses Même séquence de reconnaissance de lADN : GCC G/TGG GCG Induction par NGF (culture cellulaire ) Zhican Qu 1998 Impliqué dans stimuli douloureux

9 Egr-4 : Deux principales études Impliqué dans mecanosensation (vibris et cortex somata-sensoriel) suite à un stimulus mécanique physiologique Introduction (Mack et al., 1995). PCR ARNm egr-4

10 Objectif de la thèse Implications et rôles du facteur de transcription EGR-4 en tant mécano senseur

11 Objectifs Egr-4 impliqué dans Hypersensibilité colique chez lanimal? Quels sont ces partenaires? Par quels mécanismes cela passe-t-il? Implications et rôles du facteur de transcription EGR-4 en tant que mécanosenseurs

12 Plan de travail Souris saines Rôle dans Mécanosensibilité viscérale? Quels sont les partenaires? Dans quels tissus et à quel moment est-il le plus présent? Caractérisation de la cible

13 Plan de travail Souris saines Rôle dans Mécanosensibilité viscérale? Implication dans hypersensibilité colique? Quels sont les partenaires? Dans quels tissus et à quel moment est-il le plus présent? Caractérisation de la cible Modèle post-infectieux Modèle stress Modification dexpression? Changement de partenaires? Cinétique différente?

14 Protocole Souris wt sans traitement. Distension à 100 µL pendant 10 s. Prélèvement 30 min, 1h30 et 3h30 après distension. Colon Partie distendue Moelle DRG viscéraux L6 et S1 seringue + sonde rectale

15 Premiers résultats IHC Anticorps au point pour les trois structure Colocalisation avec des fibres nerveuses plus précisement sensitives Egr-4 nucléaire et/ou cytoplasmique Paraffine Anti-NGFI-C 1:500 Anti-goat (secondaire) 1:1000

16 Premiers résultats IHC Colon seringue + sonde rectale

17 Colon Premiers résultats IHC DRG cytoplasmeDRG noyau

18 Colon Premiers résultats IHC Corne dorsale de la moelle épinière DRG cytoplasme DRG noyau

19 Egr-4 colon souris distendus vs non distendus C 30 1h30 COLON ARNm protéine baisse dexpression de egr 4 au niveau colique

20 Egr-4 DRG souris distendus vs non distendus C 30 1h30 DRG ARNm protéine baisse dexpression de egr 4 dans les DRG

21 Egr-4 moelle souris distendus vs non distendus Moelle C 30 1h30 ARNm protéine augmentation de EGR4 dans la moelle.

22 Conclusion Outils détudes (PCR, WB, IHC) disponibles et mis au point Résultats avec des tendances différentes de ceux obtenus chez la plante et au niveau cérébral chez la souris (confirmation en cours). Confirmation de lintérêt de létude de cette cible dans la mécanosensibilité

23 Suite du travail Cinétique dexpression du facteur. DCR 30 (45) 1h (1h15) 1h30 DCR (1h) 1h30 (2h) 2h30 (3h) 3h30 ARNm Proteine

24 Suite du travail Cinétique dexpression du facteur. Localisation plus fine en immunohistologie (whole mount).

25 Suite du travail Cinétique dexpression du facteur. Localisation plus fine en immunohistologie (whole mount). Identification des cibles et partenaires. choc osmotique qPCR Culture cellulaire MODE-K WB microarray

26 Merci de votre attention

27 Corrélation volume de distension-expression egr-4 ARN m et protéine qPCR Western Blot Prélèvements au temps choisis Distension des animaux avec différents volumes : 20 µl 40 µl 60 µl 80 µl 100 µl 120 µl

28 J-3J-2J0J1J2J3J9 Administration néomycine (2 g/mL) dans eau de boisson Gavage PBS ou 10 9 CFU/souris (AIEC LF82 ouMG1655) Distension colorectale Modèle post-infectieux Souris KI pour le gène humain ceacam6 : site de liaison LF82 meilleure implantation des bactéries Implantation électrodes

29 DCR J9 Résultats modèle post-infectieux

30 Résultats modèle stress Réponse moyenne de sensibilité colique DCR réalisée à lage adulte


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