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Expression du système endothéline et effet sur la prolifération dans la muqueuse et le bulbe olfactif de rat Réunion BoB du 19 mai 2010 Présentation par.

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1 Expression du système endothéline et effet sur la prolifération dans la muqueuse et le bulbe olfactif de rat Réunion BoB du 19 mai 2010 Présentation par Arthur de Fouchier

2 Système endothéline : 3 peptides connus : Et-1, Et-2, Et-3 2 RCPG : EtA et EtB Antagonistes : Bq788 et Bq123 (respectivement) Synthèse sous forme de prépro-Et, clivés par furine pour donner Big-Et puis clivés par Ece-1 pour donner les Et actives. Effet Vasoconstricteur dans un nombre important de tissus Notamment système nerveux Maria Vidovic et al (2008) et Wei-Min Zhang et al (2008) : Preuves deffets prolifératifs et anti-apoptotique de lendothéline sur différent tissus et cellules Rappel des données :

3 Mac Cumber et al (1989) : Expression de recepteurs à lendothéline dans la muqueuse olfactive dembryons de rats Rappel des données : ET binding sites in the 19-day rat fetus. (B) ET binding Sites. Cb, cerebellum; H, heart; I, intestine; Li, liver; Lu, lung; M, meninges; NM, nasal mucosa; P, penis.

4 Rappel des données : Système endothéline est exprimé dans les cellules de la muqueuse olfactive Endothelin-related mRNAs from adult rats OM (OM adult), and newborn rats (P0–P7) OM cells prepared at the time of culture (0 DIV), or after 7 and 17 days in vitro (7 and 17 DIV) (n3 independent cultures for each). PCR products for ETA, ETB, ECE-1, ET-1 and ET-3 mRNAs were detected on 1.5% agarose gels stained with Ethidium Bromide. Negative controls consisting of PCR without DNA matrix were systematically performed (C lane). Résultats Immunohistochimie : Cellules non-neuronales Neurones Elodie Gouadon et al. (2010)

5 Rappel des données : Elodie Gouadon et al. (2010) : Preuves deffets de lendothéline sur des cultures primaires de muqueuse olfactive. (Graph?/ Schéma) Iman Laziz (Publication en cours) : Preuves deffets anti-apoptotique de lendothéline. Et-A Et1 Et-B Et-B Et-A

6 Questions posées par ces données Sites de synthèse de lendothéline et de lenzyme de conversion dans la MO? Types cellulaires? Effets de lendothéline sur la prolifération des cellules de la MO?

7 Matériels et méthodes Hybridations In Situ pour Et-1, Et-3 et Ece-1 sur des coupes de muqueuses olfactives, et de bulbe olfactif. Contrôle par OMP. Préparation des sondes : PCR à partir dADN génomique de rat et damorces spécifiques Ligation avec plasmides pGEMt Transfection dans bactérie Xl2-blue Extraction plasmides Synthèse sondes par transcription in vitro Dig-dUTP (Sp6, T7) Contrôle marquages des sondes :

8 Matériels et méthodes Hybridation in situ de sondes OMP7 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat Ctrl : sans sonde S : Hybridation avec sondes sens. A-S : Hybridation avec sondes anti-sens. BO : Bulbe Olfactif Mi : Cellules Mitrales EPL : Zone Plexiforme Externe Gl : Glomerules MO : Muqueuse olfactive SM : Sous-muqueuse CN : Cavité Nasale EO : Epithélium Olfactif Test protocole dHIS : Le transcrit OMP est bien détecté dans la MO par le protocole dHIS utilisé. CN EO SM Mi EPL Gl BO MO

9 Résultats – HIS ET-1 Hybridation in situ de sondes Et-1 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat. Ctrl : sans sonde, S : Hybridation avec sondes sens, A-S : Hybridation avec sondes anti- sens. Le transcrit Et-1 est présent au niveau apical et médian de lEO. Dans le BO, lexpression du transcrit Et-1 est détectée au niveau des cellules periglomérulaires. Le marquages des cellules mitrales semble peu spécifique. MO BO

10 Résultats – HIS Et-3 On observe surtout un marquage non-spécifique. Mélange sonde suspecté ou expression dEt-3 dans les deux sens? Hybridation in situ de sondes Et-3 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat. Ctrl : sans sonde, S : Hybridation avec sondes sens, A-S : Hybridation avec sondes anti-sens. MO BO

11 Résultats – HIS Ece-1 Dans lEO, le transcrit Ece-1 est exprimé dans une majorité des cellules medianes. Dans le BO, le marquage avec Ece-1 semble spécifique seulement au niveau des cellules periglomérulaires Hybridation in situ de sondes Ece-1 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat. Ctrl : sans sonde, S : Hybridation avec sondes sens, A-S : Hybridation avec sondes anti- sens. MOBO

12 Résultats – Cultures Cellulaires Cultures cellulaires Cultures type « Denise » Etude prolifération : 3H-T Mesure chiffrée de la prolifération. BrdU Quantification du pourcentage de cellules en phase S. Ki67 Antigène marqueur de prolifération.

13 Résultats Quantification prolifération par 3H-T:

14 Résultats Cultures en boites B12 : Aucun effet prolifératif de lendothéline dans les conditions expérimentales. Effet prolifératif des Bq? Soit, lendothéline a des effets anti-prolifératifs et il y a une production locale dendothéline saturante. Soit lendothéline a des effets différentiateur. Soit Bq a un effet sur une autre voie. Cultures en boites P96 : Cultures se développent bien En sérum 10% : Et-1 et Bq ont un effet prolifératif. En sérum 2%, Et-1 semble avoir un effet négatif sur la prolifération Théorie différentiation

15 Résultats Marquage BrdU sur culture de 7J Marquage Ki67 sur culture de 7J Aucune analyse pour le moment

16 Perspectives Expression du système endothéline : HIS avec co-marquage FISH + Immunohistochimie par fluorescence co-marquage avec réactions colorimétriques Marquage de coupes successives Une coupe HIS Une coupe immunofluorescence avec marqueurs de types cellulaires Effets sur la prolifération : Besoin de confirmer les résultats par dautres cultures Test théorie différentiation par marquages en immunofluorescence de cultures


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