Génotypage rhésus D fœtal à partir du sang maternel :

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1 Génotypage rhésus D fœtal à partir du sang maternel :
apports et limites > J.M. COSTA Laboratoire PASTEUR CERBA Paris le 7 novembre 2008

2 Génotypage rhésus D fœtal
Conflits d’intérêts déclarés JM Costa Laboratoire Pasteur Cerba (Privé): salarié Laboratoire LFB (Rhophylac®): aucun Institut Jacques Boy (Free DNA fetal kit®RhD): aucun

3 Diagnostic prénatal à partir du sang maternel
L’ADN fœtal sérique ou plasmatique  (ADN fœtal libre circulant) Cellules fœtales circulantes 

4 Diagnostic prénatal à partir du sang maternel
ADN fœtal libre: difficultés et limites d’analyse Ne représente que 3 à 6% de l’ADN plasmatique Analyse restreinte aux séquences « paternelles »

5 Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage RHD
Les bases moléculaires du phénotype RhD-négatif + 42% + Phénotype RhD-positif 85% + 43% del del Phénotype RhD-négatif 15% del

6 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe
Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (d’origine paternelle) dérivées du gène RHD Génome paternel RhD-positif Ex Ex Ex10 Sang maternel Génome maternel + Génome foetal Fœtus RhD-positif Génome maternel + Génome foetal Fœtus RhD-négatif

7 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe
Les bases moléculaires du système rhésus Sensibilité Ex Ex Ex10 Allèle RHD+ Caucase Afrique noire Allèle RHD Neg « classique » 99% 18% Allèle RHD- « RHD-CE-Ds» <1% 15% Allèle RHD- « RHD» <1% 67% Fréquence du phénotype RhD-négatif: 15-17% 3-5%

8 Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel
Les limites  Génome paternel RhD-positif Ex Ex Ex10 Sang maternel Génome maternel + Génome foetal Fœtus FAUX-Positif 

9 Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel
Les limites Génome paternel RhD-positif Ex Ex Ex10 Sang maternel  Génome maternel + Génome foetal Fœtus ? « Unconclusive result »

10 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel
Les limites: aucun test ne sera jamais parfait Les « unconclusive results » variants du gène RHD chez la mère Les faux-positifs variants du gène RHD chez le foetus Procédure de laboratoire (contaminations) Vanishing twin Les faux-négatifs Procédure de laboratoire (défaut de sensibilité) variants du gène RHD Injection inutile anti-D Risque infectieux  0 (?) Allo-immunisation  13%

11 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel
Expériences récentes en Europe

12 Pourquoi faut-il proposer le génotypage RHD fœtal ?
Recommandation du CNOGF 2005 Intérêts Cà marche ! Limiter l’exposition à des produits dérivés du sang Limiter l’utilisation des immunoglobulines (stocks limités) Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004;111: ) Pour éviter 1 cas d’allo-immunisation, il faut traiter: 278 femmes en l’absence de génotypage 166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif

13 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel
Frein à sa généralisation Déficit d’information des patientes et des professionnels Laboratoires Activité de diagnostic prénatal (génétique moléculaire) Autorisation de diagnostic prénatal par l’ARH Praticiens agréés par l’Agence de la Biomédecine Coût du test Remboursement (B700: 189€ par assimilation diagnostic prénatal) suspendu depuis janvier2008 (décision CNAM unilatérale) Sanquin-NL (149€), Pasteur-Cerba-FR (150€), IGBRL-UK (279€) Haute Autorité de Santé saisie début 2008 Intérêt économique incertain

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15 Intérêt économique du génotypage RHD foetal systématique?
Etude pilote: A.Benachi, N Léticée N, JM Jouannic JM, Y Ville, JM Costa Hôpital Necker-Paris, CHI Poissy, Hôpital Trousseau, Hôpital Américain de Paris Suivi de 101 patientes RhD négatives (Caucase.93, Afr.Nord7, Antilles 1) Génotypage fœtal non interventionnel au premier trimestre: terme moyen 13SA Pas de prophylaxie systématique à 28SA Décompte: RAI, Test de Kleihauer, Groupe, Rhophylac, Soins infirmiers Résultats Génotypage RHD fœtal 2 résultats « unconclusive » (Caucase1,Antilles1) 75 patientes à risque (fœtus RHD-positif) 24 patientes avec fœtus RHD-négatif (25%) Prophylaxie ciblée: 23 patientes 12 amniocentèses 11 saignements et traumatismes

16 Evaluation des coûts: impact de la prophylaxie systématique
1 Coût moyen par patiente: 242€ Coût moyen par patiente: 331€ (+36.8%) 2 Prévention ciblée Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Conjoint (à documenter) Détermination du groupe rhésus Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer Anti-D 200µg Test de Kleihauer

17 Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?
1 Coût moyen par patiente: 242€ Coût moyen par patiente: 331€ (+36.8%) 2 Prévention ciblée Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage €/test 464€ si génotypage €/test 599€ si génotypage €/test Génotypage RHD foetal 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique X Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé A titre de repère Test de Kleihauer € PCR Chlamydia UR € PCR Toxo LAMN € NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer Test commercial RHD en duplicate €

18 X X Quelle stratégie? 1 2 Coût moyen par patiente: 242€
331€ (+36.8%) 2 Prévention ciblée Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage €/test 464€ si génotypage €/test 599€ si génotypage €/test De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Génotypage RHD foetal 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique X X Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 46€/test 440€ si génotypage €/test 574€ si génotypage €/test Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer

19 Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?
1 Coût moyen par patiente: 242€ Coût moyen par patiente: 331€ (+36.8%) 2 Prévention ciblée Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage €/test 464€ si génotypage €/test 599€ si génotypage €/test Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif Génotypage RHD foetal De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 87€/test 399€ si génotypage €/test 532€ si génotypage €/test X 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique X Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé X NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer

20 Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage?
1 Coût moyen par patiente: 242€ Coût moyen par patiente: 331€ (+36.8%) 2 Prévention ciblée Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage €/test 464€ si génotypage €/test 599€ si génotypage €/test Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif Génotypage RHD foetal Taux de Fœtus RHD Neg Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage €/test 399€ si génotypage €/test 532€ si génotypage €/test De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois 25% X Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage €/test 370€ si génotypage €/test 501€ si génotypage €/test 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique X 33% Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé X Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage €/test 319€ si génotypage €/test 453€ si génotypage €/test NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif 50% Anti-D 200µg Test de Kleihauer

21 Peut-on réduire la demande de génotypage?
Phénotypage rhésus CDE du conjoint (B75:25€) + + + del Fœtus RhD-positif  100% Fœtus RhD-positif  50%

22 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel
Questions à réponses variables ADN fœtal sérique ou plasmatique? Quel délai pour l’acheminement de l’échantillon au laboratoire? Quel test proposé:1ère, 2ème ou 3ème génération? Doit-on contrôler les résultats négatifs? Doit-on contrôler les résultats sur liquide amniotique si amniocentèse? A quel terme? A quelle patiente doit-on proposer le test? Patientes allo-immunisées Patientes devant avoir un geste invasif Toutes les patientes RhD négatives

23 Test de Kleihauer: contrôle de qualité
Simmonet et al. Annales de Biologie Clinique 2001 échantillon C: 50 hématies fœtales/ 1 2 3 4 5 Nbre d’injections anti-D