Développement du FRET pour l'analyse qualitative et quantitative des interactions protéine-protéine (NO2001-043) Utilisation du couple GFP/DsRed pour l’analyse.

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1 Développement du FRET pour l'analyse qualitative et quantitative des interactions protéine-protéine
(NO ) Utilisation du couple GFP/DsRed pour l’analyse d’interactions entre protéines par FRET chez les plantes. Laboratoire Commun de Cytologie

2 Pasticcino1: un régulateur du développement chez Arabidopsis
Perte de PAS1 conduit à la prolifération cellulaire anarchique PAS1::GFP BY2 Cells PAS1 est une protéine cytosolique PAS1 migre du cytosol vers le noyau pendant la mitose WT Pas

3 Pasticcino1: un régulateur du développement chez Arabidopsis
PASTICCINO1 appartient à la famille des immunophilines Elle est caractérisée par plusieurs domaines d’interaction protéine-protéine NLS Domaines FKBP TPR CaMBD PAS1 FKBP : FK 506 binding proteine (droguue immuno suppressive) la drogue+ la proteine bloque la réponse des lymphocytes T TPR : tétratricopeptiderepeat c’est une répétition de 34 aa CaMBD lit la calmoduline Quels sont les partenaires protéiques de PAS1? Laboratoire Commun de Cytologie

4 PASTICCINO1 “interagit”
avec un facteur de transcription de la famille NAC protein PAS1/FAN in vitro interaction PAS1 ∆CaMBD:STREP 92 52 35 29 21 7 PAS1:STREP - @ MBP FAN (FKBP Associated NAC) Isolé par double hybride dans la levure PAS1DCaMBD . MBP: maltose banding proteine (lie le maltose) On a chargé les partenaires dans la levure. On a cherché les partenaires dans une banque et on a sorti dans la levure des proteines qui interagissent avec PAS1. On a sorti FAN qui est un facteur de transcription NAC impliqué dans le méristème et le cycle cellulaire. Avant de se lancer dans les manips de FRET on a vérifié qu’il y avait bien interaction entre les deux protéines FAN MBP A valider in vivo Laboratoire Commun de Cytologie

5 couples donneur/accepteur possibles:
FRET avec quel système? D A D A + : nombreuses constructions GFP bonne séparation à l’émission - : aggrégation DsRED recouvrement à l’excitation couples donneur/accepteur possibles: Combinaison FRET: BFP/ GFP CFP/ YFP CFP/ DsRed GFP/ DsRED Utilisation du couple GFP/DsRED pour le FRET? Laboratoire Commun de Cytologie

6 Y a t-il interaction entre PAS1 et FAN ou simplement colocalisation ?
Colocalisation de PAS1 et FAN dans des cellules épidermiques de Nicotiana benthamiana (expression transitoire). 35S GFP 35S FAN DsRED2 PAS1 domaine Cter nécessaire pour l’exclusion du noyau en interphase Pas1 agrégats qu’en présence de FAN et que avec son domaine Cter. Il y a colocalisation des agrégats --- c’est déjà un bon indice d’interaction. Cela nous a permis de lancer des manips FRET PAS1 interagit en double hybride et in vitro avec un facteur de transcription FAN (FKBP associated NAC) PAS1 colocalise avec FAN Le domaine C-terminal (CaMBD) de PAS1 est nécessaire en double hybride et in vitro pour l'interaction avec FAN Premiers résultats de FRET entre PAS1 et FAN Y a t-il interaction entre PAS1 et FAN ou simplement colocalisation ? Choix d’une approche FRET Laboratoire Commun de Cytologie

7 Matériel disponible à l’IJPB de Versailles
Confocal Leica TCS-NT premiers tests de FRET + Ar/Kr raie mW puissante pour exctinction - Pas de possibilités pour ROIs (uniquement le zoom) - Système trop lent -Confocal Leica SP2 AOBS + Module FRET intégré (automatisation) - HeNe 543 faible 1,2 mW pour exctinction +Beam Expander pour concentrer le faisceau Laboratoire Commun de Cytologie

8 Module FRET du SP2 AOBS Mesure de l’augmentation de fluorescence de l’accepteur par transfert d’énergie non radiatif d’une molécule excitée du donneur Mesure de l’augmentation de fluorescence du donneur Après extinction de l’accepteur Laboratoire Commun de Cytologie

9 Module FRET du SP2 AOBS Recouvrement important à l’excitation (nécessite un seuillage précis de l’émission DsREd après excitation par la raie 488 de la GFP) - Les réglages ne sont pas répétables entre cellules: fluctuations de concentration intra/inter cellules mouvements xy et z Ce module n’a pas été utilisé car les réglages n’étaient pas les mêmes entre cellules. trop de variations entre cellules. Nécessité d’une mesure dans une seule cellule Laboratoire Commun de Cytologie

10 Mesure de FRET par "Acceptor Bleaching "
100 % Ed1 Ed2 Ea1 Ea2 D A D A D A D A Une image est prise du donneur puis de l’accepteur. L’intensité de leur fluorescence est mesurée. Les molécules de l’accepteur sont détruites dans une zone définie à l’aide d’une intensité de laser élevée. (DECOLORATION) Cette décoloration est paramétrée. Si le FRET a lieu on constate une augmentation d’intensité du donneur dans la zone décolorée. Calcul de l’efficacité FRET Ed2- Ed1 %FRET = x100 Ed2 Laboratoire Commun de Cytologie Avantage: Contrôle et tests réalisés sur une seule cellule dans une même ROI

11 + Définir les paramètres d’acquisition pour le donneur et l’accepteur
(1 canal et 1 longueur d’onde pour chaque) Fixer le taux d’intégration pour limiter le bruit de fond (Li A.) Ea1 D A                   +         Laboratoire Commun de Cytologie

12 Régler le laser pour la décoloration de l’accepteur
Définir la zone devant être décolorée Choisir le nombre de passages du laser sur la zone, ou le % de décoloration (régulation) 543 Laboratoire Commun de Cytologie

13 Ed2- Ed1 %FRET = x100 Ed2 DonneurAccepteurPre ROIPreBleach ROIBleach
DonneurAccepteurPost FRET_Eff Ed1 Ea1 D A D A D A Ed2 D A Automatisation de l’acquisition Ed2- Ed1 %FRET = x100 Ed2 Laboratoire Commun de Cytologie

14 Mesure de FRET par "Acceptor Bleaching "
Photoblanchiment de l’accepteur 4 scans laser 543nm %FRET = Ed2-Ed1 Ed1 x100 Ed1 pre 552,29 Ed2 post 626,23 Ea1 pre 450,8 Ea2 post 262,8 FRET% 13,38 Ea1 Ea2 Ed2- Ed1 En bleu, sont représentées les zones où l’émission de fluorescence du donneur est stable au cours du temps. Les zones verte à rouge constituent des variations de fluorescence de moins vers plus. Laboratoire Commun de Cytologie

15 Mesure de FRET par "Acceptor Bleaching "
PAS1:GFP DsRED:FAN FRETeff = (d2 – d1)/d2 =15.12% d1= (a.u) d2= (a.u) PAS1ΔCaMBD:GFP DsRED:FAN FRETeff = (d2 – d1)/d2 = 0.00% d1= (a.u) Laboratoire Commun de Cytologie d2= (a.u)

16 Analyse quantitative du FRET
C % FRET Experiments number FRETefficiency % FRET by acceptor photobleaching PAS1::GFP PAS1∆CaMBD::GFP PAS1::GFP PAS1∆CaMBD::GFP Laboratoire Commun de Cytologie

17 • Optimisation des résultats
Quelques conseils pratiques : • petite ROI pour minimiser l’effet des flux par un temps plus court de décoloration. • aires de décoloration contenant des signaux GFP / DsRed diffus, similaires et peu concentrés pouvant représenter des zones où les protéines sont solubles. • importance des contrôles négatifs (la GFP seule n’est pas idéale car elle est très mobile). Ed1 Ed2 Ed2- Ed1 • Optimisation des résultats - vérification OFFLINE sur des ROI voisines non décolorées pour validation de l’expérience. - décoloration de l’accepteur ≈ à 40% permettant de conserver l’échantillon.  - rapport Apré /Dpré compris entre 0.5 et 2  - grande stabilité de fluorescence du donneur au cours du temps pour éliminer tous les artéfacts dus à des fluctuations naturelles de la GFP (vérification par Time lapse). Ainsi, toutes les données finalement supprimées l’ont été sur des critères expérimentaux et non sur les résultats obtenus. Laboratoire Commun de Cytologie

18 ETUDE D’INTERACTION ENTRE PROTEINES PAR FRET EN MICROSCOPIE
PROTOCOLE LOURD A METTRE EN PLACE : valable uniquement si on veut aller dans le détail Par exemple si on veut faire un suivi dans le temps ou dans l’espace. Sinon il existe d’autres techniques qui peuvent simplement valider les interactions sans rentrer dans le détail. Par exemple la technique « split YFP » permet de vérifier s’il y a interaction ou pas mais c’est un système irréversible avec impossibilité de faire des cinétiques. CRITERES PREREQUIS : - vérification de l’interaction entre les protéines in vitro - vérification de la colocalisation in vivo en microscopie - nécessité d’un contrôle négatif - choix du protocole d’étude * acceptor bleaching * donnor bleaching * sensitized emission * FLIM * anisotropie de fluorescence Laboratoire Commun de Cytologie

19 The Pasticcino team: Yannick Bellec Inra-IJPB (BioCell)
Jean-Denis Faure Inra-IJPB (BioCell) François Roudier Inra-IJPB (BioCell) Cybelle Smyczynski Inra-IJPB (BioCell) Olivier Grandjean Inra-IJPB (LCC) Halima Morin Inra-IJPB (LCC) Catherine Bergougnioux IBP Claudette Perennes IBP Spencer Brown☺ CNRS Gif The Pasticcino team: Laboratoire Commun de Cytologie