Apport de l’amplification multiplex puis séquençage NGS des 5 gènes majeurs de Cardiomyopathie Hypertrophique : Spectre des mutations et CNVs chez 1259.

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1 Apport de l’amplification multiplex puis séquençage NGS des 5 gènes majeurs de Cardiomyopathie Hypertrophique : Spectre des mutations et CNVs chez 1259 patients Flavie Ader Dr Pascale Richard UF Cardiogénétique et Myogénétique, Service de Biochimie Métabolique, Paris, (F- 75013), France, Hôpitaux Universitaires de la Pitié- Salpêtrière- Charles Foix, Paris – France

2 2 Cardiomyopathies Hypertrophiques Hypertrophie du ventricule gauche, souvent asymétrique (septum) caractérisée par un septum interventriculaire ≥ 13 mm. Prévalence: 1/500 Transmission: dominante Pénétrance: variable selon l' âge et gène dépendant Hétérogénéité génétique: mutations privées Hétérogénéité clinique: variabilité inter individus et intrafamiliales Patient asymptomatique Trouble du rythme Insuffisance cardiaque Mort subite Diagnostic: échographie cardiaque www.cardiogen.aphp.fr Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

3 3 Etiologie des cardiomyopathies hypertrophiques Histologie (ME) pathology.jhu.edu Maron BJ. et al, The Lancet, 2013. Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France MYBPC3 TNNI3, TNNT2 MYH7, MYL2

4 4 Cardiomyopathies : Aspects génétiques 1987: découverte du premier gène MYH7 5 gènes majeurs MYH7, MYBPC3, MYL2, TNNI3, TNNT2 Elliott et al. ESC Guidelines, EHJ 2014;35(39):2733-79. Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

5 5 Apport des nouvelles technologies de séquençage Etude rétrospective sur les 1259 cas de CMH ayant bénéficié d’un screening par NGS des 5 gènes majeurs des CMH (MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, MYL2) Apport du NGS ? Rendement mutationnel ? Détection de nouveaux types de mutation ? Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

6 6 Matériel et méthodes (1/2) 1259 patients atteints de CMH (séries de 96 patients) Technologie Multiplicom (MASTR Assay Cardiomyopathy) amplification multiplex des 5 gènes majeurs de CMH (MYH7, MYBPC3, MYL2, TNNI3, TNNT2) Cibles : exons codants = 135 fragments (23 Kb) dont 5 amplicons contrôle (5 plexs) Séquençage de 96 patients/run Flow cell 2*300 V3, Miseq® Illumina Gene scan fragments d’amplification Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

7 7 1) Amplification PCR multiplex des exons cibles dans 5 plexs différents pour chaque patient 2) Tous les fragments amplifiés sont indexés avec des MID et des séquences nécessaires au séquençage (grands fragments 300-400 pb) 3) Multiplexage des plexs d'un patient 4) Mutiplexage des 96 patients et séquençage par bridge amplification (Miseq®) Matériel et méthodes (2/2) Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

8 8 Visualisation des résultats SeqPilot ®: Alignement des séquences Hg19, et annotation des variants Interprétation des variants: Qualité des séquences (> 30x, équilibre R1/R2) Fréquence rare dans la population (<0,1 %), (EVS, 1000G, ExaC) Sites de prédiction in silico de la conséquence protéique (SIFT, Polyphen, GVGD, Mutation taster) Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

9 9 Validation de la technologie en diagnostic Sensibilité: * Couverture moyenne par cible * Capacité à détecter tout type de mutation (substitutions, Indel, CNVs) Spécificité: pas d’amplification des gènes homologues (MYH6) Répétabilité: intra run Reproductibilité: inter-run, inter-techniciens Exemple de couverture cumulée par gènes, série 9 (Kit V3) – 96 pts Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

10 10  Séquençage des patients amène à un diagnostic chez 38 % (n=476/1259) patients.  90 % des patients (n=429) sont porteurs d’un variant pathogène et 10 % (n=47) de deux variants pathogènes Résultats (1/5): Analyse des 5 gènes majeurs Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

11 11 Résultats (2/5): Distribution des gènes 271 mutations différentes identifiées  147 dans le gène MYBPC3  84 dans le gène MYH7  20 dans le gène TNNT2  13 dans le gène TNNI3  7 dans le gène MYL2 Distribution des gènes majeurs des CMH chez les patients mutés (n= 476) Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

12 ELEMENTS CONNUS  Taux de diagnostic de 38 %  Distribution des gènes chez les patients génotypés conforme à la littérature AVANTAGES  5 gènes simultanément  Gain sensibilité si doubles mutants  Nombre de patients testés (96 par run/mois) – gain de débit/temps  Facilité d’interprétation (20-40 variants/patient) 12 Résultats (3/5): Apports de la technique → SNV et insertion/délétion de petites tailles, largement décrits → Peu d'études des variations structurales de type CNVs Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France L.R. Lopes et al. European Journal of Medical Genetics 58 (2015) 611-616

13 13  Analyse des CNVs (Genodiag®) RC amplicon normalisé ROI Référence RC normalisé ROI (RC amplROI/ Somme RC amplcontrol) 1 échantillon moyenne (RC amplROI/ Somme RC amplcontrol) tous les échantillons  Ratio 1,3 duplication suspectée  Interprétation : 1) qualité technique (≤ 2 patients porteurs du même CNV) 2 ) amplicons contigüs touchés 3) qualité de l’ADN (≤ 2amplicons avec un CNV/patient)  Vérification : MLPA (MYBPC3, MYH7, TNNI3) ou par qPCR Résultats (4/5) : Détection des CNVs Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

14 14 Résultats (5/5): Détection des CNVs 14/1259 patients sont porteurs d’un CNV  MYBPC3 : 7 délétions et 1 duplication  MYH7 : 1 délétion  MYL2 : 2 délétions  TNNI3 : 1 délétion  TNNT2 : 1 délétion et 1 duplication Délétion exons 24 à 33 MYBPC3 Fréquence estimée des CNVs des 5 gènes majeurs dans les CMH environ 1 % Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

15 15 Conclusions  Analyse simultanée des 5 gènes majeurs  Détection des CNVs → Elargissement du spectre des anomalies moléculaires responsables de CMH  Multiplexage par 96 patients/série permet un rendu diagnostic plus rapide  Interprétation bioinformatique plus rapide et fiable  Meilleur conseil génétique aux patients et aux familles Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

16 16 Elliott et al. ESC Guidelines, EHJ 2014;35(39):2733-79. Rapezzi et al. ESC WG Position Paper, EHJ 2013;34:1448. Workflow du conseil génétique aux patients dans les CMH Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France

17 17 Remerciements  Centre de référence national des maladies cardiaques Héréditaires P. Charron  Centres de compétence en France  Bordeaux  Lille  Rouen  Toulouse  Dijon  …………..  UF Cardiogénétique et Myogénétique P. Richard F. Ader C. Vegas N. Caillaud L. Demay K. Gaudon S. Lebreton

18 18 Variation structurales : CNVs L.R. Lopes et al. European Journal of Medical Genetics 58 (2015) 611-616 505 cas index atteints de CMH génotypés par NGS capture sur 41 gènes de cardiomyopathies CNVs retrouvés chez 4 patients (0,8 % de la cohorte)  une large délétion du gène MYBPC3  une large délétion du gène PDLIM3  une duplication entière du gène TNNT2  une large duplication du gène LMNA Assises de Génétique- 3-5 Février 2016- Lyon France