Les Mycobactéries : classification, méthodes d’identification classiques et pathogenèse Pr Mireille Dosso.

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1 Les Mycobactéries : classification, méthodes d’identification classiques et pathogenèse
Pr Mireille Dosso

2 Un brin d’Histoire 400 av. J-C : Hippocrate : Phtisie = tuberculose pulmonaire :  Jean Antoine Villemin démontre l'infection :  Robert Koch isole "son" bacille BK :  C. Flügge : origine de l'infection : gouttelettes produites lors de la toux. mise au point du BCG en 1921 par Calmette et Guérin tuberculose joue un rôle central dans La Dame aux Camélias (1848) d' Alexandre Dumas fils et dans l'opéra de Giuseppe Verdi, La Traviata (1853). Tuberculeux célèbres :John Keats ( ), Robert Stevenson ( ), George Orwell ( ), Franz Kafka ( ) et Thomas Mann (1875 à 1955) qui a décrit l'univers des sanatoriums dans La montagne magique (1924). séquençage complet du génome de M. tuberculosis en 1998.

3 Classification

4 Le principal point commun à toutes ces espèces appartenant au genre Mycobacterium, placé dans l'ordre des Actinomycétales, est une propriété tinctoriale pathognomonique mise en évidence par la coloration de Ziehl-Neelsen: l’acido-alcoolo-résistance.

5 Plus de 100 espèces de mycobactéries
3 seulement sont pathogènes / homme – Mycobacterium tuberculosis : la tuberculose – Mycobacterium leprae : la lèpre – Mycobacterium ulcerans : l ’ulcère de Buruli • AUTRES => SAPROPHYTES • occasionnellement opportunistes ,si immunodépression locale ou systémique L ’histoire naturelle des infections par mycobactéries est différente s’il s’agit de mycobactéries pathogènes ou opportunistes

6 famille des Mycobacteriaceae
• ordre des Actinomycetales • genre Mycobacterium

7 Diversité du genre Mycobacterium
après comparaison des séquences du gène rpoB

8 Mycobactéries Tuberculose Lèpre « Atypiques »

9 Le complexe tuberculosis qui se subdivise lui-même en plusieurs espèces, dont on peut mentionner:
• Mycobacterium tuberculosis = Bacille de Koch = BK: mycobactérie humaine, agent de la tuberculose. L'infection humaine est surtout respiratoire. • Mycobacterium bovis: mycobactérie animale (bovidés), occasionnellement agent de la tuberculose chez l'homme. L'infection humaine est surtout intestinale (lait). • Mycobacterium africanum: mycobactérie humaine, agent de la tuberculose isolé en Afrique tropicale.

10 Mycobacterium leprae: mycobactérie humaine, agent de la lèpre
Mycobacterium leprae: mycobactérie humaine, agent de la lèpre. M leprae murium Mycobactéries atypiques: sont généralement ubiquitaires (eaux, sols, plantes, poussières, etc.). - MOTT = Mycobacteria Other Than Tuberculosis - MAMT = Mycobactéries Autres que les Mycobactéries de la TB - MNT = Mycobactéries Non Tuberculeuses

11 Mycobactéries tuberculeuses
Complex Tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium africanum Mycobacterium bovis Mycobacterium bovis B.C.G. (bacille de Calmette et Guérin) Mycobacterium microti

12 Classification des Mycobactéries Atypiques
Pathogènes stricts M. ulcerans: ulcère de Buruli M. marinum: granulomes M. haemophilum: lésions cutanées disséminées M. paratuberculosis: entérite hypertrophiante des ruminants Pathogènes opportunistes Infections pulmonaires Adénites Infections osseuses, cutanées ou disséminées Espèces saprophytes ou commensales Jamais ou rarement responsables d’infection

13 Classification selon le type d’infection
- Infections pulmonaires M avium et intracellulare, M. kansasii, M. xenopi, M. malmoense; - Infections ganglionnaires : M. avium - intracellulare, M. scorofulaceum, M. kansasii; - Infections cutanées : M. marinum, M. ulcerans, M. chelonae. - Pus et épanchement : M. avium-intracellulare, M. chelonae, M. kansasii, M. xenopi, M. abcessus; - Infections systémiques : M. avium-intracellulare, M. kansasii, M. haemophilum, M. xenopi, M. gevanense.

14 Classification de Runyon
Première classification encore utilisée aujourd’hui comme orientation dans l’identification Caractères phénotypiques: vitesse de croissance sur des milieux de culture température optimale pigmentation

15 Groupes I, II et III espèces pathogènes strictes ou opportunistes
Groupe I: mycobactéries photochromogènes à croissance lente Groupe II: mycobactéries scotochromogènes à croissance lente Groupe III: espèces non chromogènes à croissance lente Groupe IV: pathogènes rares ou saprophytes Groupe IV: espèces pigmentées ou non à croissance rapide

16 Taxonomie Mycobactéries photochromogènes (GROUPE I)
 M. kansasii , M. marinum , M. simiae , M.asiaticum Mycobactéries scotochromogènes (GROUPE II) M. gordonae,M. szulgai, M. scrofulaceum , M. flavescens Mycobactéries non chromogènes (GROUPE III) Complexe aviaire : M. avium , M. intracellulaire ,M. xenopi Complexe terrae : M. non chromogenicum, M triviale, M. gastri, M. malmoense Autres espèces : M. ulcerans,, M. shimoidei ,M. paratuberculosis, M. farcinogene ,M.lepraemurium

17 Mycobactéries à croissance rapide (GROUPE IV)
Non pigmentées : M. fortuitum, M. chelonei, M. chitae, M. senegalense,M. fallax Pigmentées : M. Vaccae,M. vaccae-aurum,M. engloaecki Thermophiles : M. phlei Thermorésistibles : M. smeggmatis

18 Méthodes d’identification classiques

19 Caractères morphologiques
Colorations Ziehl-Neelsen à l’Auramine ou de Dugommier Morphologie 2 à 5 µm de long sur 0,5 µm de large forme rectiligne ou plus ou moins incurvée extrémités arrondies, non sporulées et non capsulés, isolés ou en amas globulaires.

20 Caractères morphologiques
Les mycobactéries retiennent les colorants malgré l'action combinée d'acides dilués et d'alcool. Cette caractéristique,appelée alcoolo-acido résistance, est due à la richesse de leur paroi en lipides. Elle est mise à profit pour la coloration différentielle de Ziehl-Neelsen.

21 Au ziehl la morphologie des bacilles peut être très évocatrice ,
mais aucun aspect n'est rigoureusement spécifique et peut varier en fonction du milieu de culture utilisé longs et fins, longs et courts, formes coccoïdes, courts, colorés de façon homogène ou non, fins granuleux avec présence d'amas serrés (cordes ou moustaches), longs, épais avec un aspect "zébré" et présence d'amas serrés ou non.

22 Ziehl Neelsen  BAAR Auramine

23 M. avium (coccoïdes) BK (cordes ou moustaches) Espèce à croissance rapide M. Kansasii (épais et zèbré)

24 Caractères culturaux

25 1- Milieux solides 2- Milieux liquides

26 Caractères culturaux: Milieux
Milieux empiriques : à l’œuf Le milieu de Löwenstein-Jensen, milieu à l'oeuf, est le milieu de référence recommandé par l'UICTMR (Union Internationale Contre la Tuberculose et les Maladies Respiratoires). Enrichi de pyruvate, il permet une meilleure croissance des mycobactèries dysgoniques (M. bovis). Lowenstein Coletsos

27 Milieux synthétiques : Middlebrook
Les milieux de Middlebrook 7HIO - 7HIl sont des milieux gélosés, plus souvent utilisés pour l'étude des antibiotiques que pour l'isolement primaire. Les milieux liquides 7H9 - 7HI2 - 7HI3 de Middelbrook, le milieu de Dubos, le milieu de Kirchner, sont des milieux d'enrichissement.

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29 MGIT

30 * Les colonies sont non pigmentées,
M. avium présente souvent des colonies de deux types : . lisses transparentes et opaques rugueuses, constituées de cocco-bacilles acido-alcoolo-résistants. * Les colonies sont photochromogènes, grosses, eugéniques, rugueuses, formées de gros bacilles à coloration en échelle : penser à M. kansasii. * Les colonies sont pigmentées à l'obscurité. Elles sont grosses, lisses, constituées de bacilles de taille moyenne, ce tableau évoque M. gordonae. Au contraire, les colonies sont petites, à croissance lente, favorisées par le pyruvate, constituées de bacilles longs et chevelus : penser à M. xenopi.

31 Critères d’orientation
Délai de croissance (apparition des colonies) Aspect des colonies: taille ou morphologie, caractère rugueux ou lisse Coloration des colonies Tous ces caractères constituent les éléments d’orientation importants

32 Test de photo induction
M. kansasii

33 Colonies eugoniques : M tuberculosis
M. africanum a des colonies rugueuses mais plates M. bovis montre de petites colonies non pigmentées et lisses qui ne grossissent pas.

34 M. gordonae M. fortuitum

35 Lépre : M leprae Elle est due à M. leprae (bacille découvert par Hansen en 1873), bactérie dont la culture reste impossible actuellement sur milieux inertes.

36 Caractères biochimiques

37 Tests biochimiques NIACINE NITRATE-REDUCTASE CATALASE UREASE
- M.tuberculosis accumule de l'acide nicotinique extracellulaire pendant sa croissance in vitro. NITRATE-REDUCTASE CATALASE UREASE BÊTA-GALACTOSIDASE ARYLSULFATASE / HYDROLYSE DU TWEEN 80 :estérase qui hydrolyse Tween 80 et libèrent l'acide oléique. BÊTA-GLUCOSIDASE UTILISATION DES SUCRES OU FERMENTATION SUCREES

38 L’identification des mycobactéries obtenues en culture pure sur milieu solide repose classiquement sur l’étude des caractères culturaux (temps de croissance, morphologie et pigmentation des colonies) et biochimiques.

39 Trois épreuves biochimiques simples permettent de faire la distinction entre bacilles du complexe tuberculosis et mycobactéries non tuberculeuses : la recherche de l’activité catalasique après chauffage pendant 20 min à 68 °C, le niacine-test et l’étude de la sensibilité à l’acide para-aminosalicylique (ou PAS).

40 M. tuberculosis aérobie strict
donne en 21 à 28 jours, sur milieu de Löwenstein-Jensen, de grosses colonies en « chou-fleur », de teinte crème-beige, à surface sèche et rugueuse. elle a une activité catalasique thermolabile (après chauffage pendant 20 min à 68 °C) et une activité nitrate réductase. naturellement résistante TCH (hydrazide de l’acide thiophène carboxylique) naturellement sensible à l’acide paraaminosalicylique PAS En cas de résistance à haut niveau à l’isoniazide, l’activité catalasique est réduite voire même absente. Dans tous les cas, M. tuberculosis accumule l’acide nicotinique, ou niacine, qui peut être révélé par l’épreuve de Konno ou niacine-test

41 M. bovis micro-aérophile
donne sur milieu de Löwenstein-Jensen de petites colonies non pigmentées, lisses et brillantes qui ne dépassent pas la taille d’une tête d’épingle, sauf si le milieu de culture est enrichi de pyruvate de sodium sensible au TCH, ne possède pas de nitrate réductase et n’accumule pas suffisamment de niacine pour donner un niacine test positif. M. africanum donne des colonies dysgoniques, plates avec un bourgeon central, rugueuses et de teinte mate, qui se développent plus rapidement et en plus grande quantité en présence de pyruvate de sodium.

42 PIGMENT CULTURE NIAC CATALASE NIT TCH Photo Scoto R Eugonique 36°c 42°c 22°c 70°c Complex Tuberculosis tuberculosis (-) (+) - + bovis africanum V BCG Groupe I kansasii ++ marinum faible Groupe II gordonae xenopi scrofulaceum Groupe III avium Non chromo ulcerans Groupe IV fortuitum Rapide smegmatis

43 La mesure de la fluorescence s'effectue grâce à un chimioluminomètre.
On remplace maintenant, lorsque l’on en a les moyens, les épreuves biochimiques par l’hybridation avec des sondes génomiques complémentaires de séquences d’ARN ribosomique, spécifiques de certaines mycobactéries,notamment de celles du complexe tuberculosis La mesure de la fluorescence s'effectue grâce à un chimioluminomètre. Des tests biochimiques doivent être effectués secondairement pour préciser l’espèce bactérienne en cause au sein du complexe tuberculosis.

44 Méthode des proportions en milieu liquide

45 Sensibilité aux antituberculeux
CI : testés 4 antituberculeux: isoniazide (INH), streptomycine, ethambutol, rifampicine

46 Pathogenèse

47 Le BK ne produit pas de toxine et doit son pouvoir pathogène
à sa capacité de persister et de se multiplier dans les macrophages. Mycobactéries de l’environnement (M avium, M kansasii…)  Colonisation Si déficit local Maladie Si déficit systémique  Maladie disséminée

48 Transmission et évolution de la tuberculose humaine

49 Entrée dans les macrophages
Lorsque le BK est inhalé, il vient se loger dans une alvéole pulmonaire où il est phagocyté par les macrophages. Le BK a la propriété de résister vivant très longtemps dans les macrophages. Certains restent sur place, d'autres sont véhiculés par voie lymphatique jusqu'aux relais ganglionnaires voisins. Le BK peut se fixer sur des récepteurs d’un certain nombre de cellules phagocytaires. La bactérie est alors internalisée par phagocytose dans une vésicule. Elle empêche la fusion du phagosome au lysosome (phagolysosome) en empêchant l’acidification de la vésicule. Elle diminue aussi le « burst oxidatif » dans le macrophage activé Elle réduit aussi la production par le macrophage de cytokine

50 Il empêche (interfère) l’activation des macrophages
Le Lipoarabinomannan des parois cellulaires supprime la prolifération des cellules T ; bloque l’activation des gènes de l’interféron Stimulation d’une réponse inflammatoire destructive pour les tissus La lyse des bactéries libère des constituants antigéniques qui suscitent une réaction immunitaire induisant un état d'hypersensibilité à l'origine de la transformation caséeuse Antigène 85 Acides mycoliques Le dipeptide muramyl La production de TNF- stimulée par les composants de la paroi cellulaire

51 Formation des tubercules
La réponse mediée par les cellules T associées aux phagocytes amène à la formation de tubercules et s’appelle la réponse granulomateuse. « granule » enveloppe de fibrine qui peut calcifier contient des bactéries vivantes qui en se multipliant peuvent éclater le tubercule  réactivation de la TB.

52 . La réaction locale aboutit en un peu plus d’un mois à une lésion histologique caractéristique:
le granulome ou tubercule qui est constitué de cellules épithélioïdes et de cellules géantes multinucléées entourées d’une couronne lymphocytaire et centrées par une zone de nécrose caséeuse. Tout peut s’arrêter à ce stade par un enkystement et une calcification des lésions suivis d’ne auto-stérilisation spontanée du chancre d’inoculation. C’est la situation la plus fréquente

53 Dans la phase de latence.
Les bactéries ne causent pas d’infection active M. tuberculosis se localise dans les tubercules ou dans les nodules lymphatiques, peut-être dans d’autres organes. Les bactéries peuvent avoir un état latent comme les spores

54 Après la formation des tubercules :
la caséification qui correspond à une nécrose solide des tissus où les bactéries se sont développées. Lorsque le caséum se ramollit, la caverne se constitue dans le poumon et s'entoure d'une coque fibreuse la rendant difficilement accessible aux drogues antibacillaires. Une dissémination hématogène est éventuellement responsable de localisations extra-pulmonaires.

55 Pathogénie de la tuberculose bovine
Voie d'infection (aérogène, bucco-pharyngée, intestinale, ombilicale Complexe primaire: chancre d’inoculation et adenopathie

56 Pathogénie de l’ulcére de Buruli (Meyers, 1995)
§  Pénétration de M. ulcerans dans la peau, §    Production de petites quantités de toxines, §    Nécrose des tissus sous-cutanés, §    Remaniement et infarcissement des tissus, §    Diminution des nutriments pour M. ulcerans et action immunologique à médiation cellulaire, §    Positivité des tests cutanés, §    Destruction et constitution de granulomes, §    Cicatrisation de l’ulcération.

57 Physiopathologie (1) M. ulcerans : germe thermodépendant,(30°C et 33°C) T° = derme profond et l’hypoderme. Mycolactone (macrolide dérivé d’un polykétide )

58 Mycolactone (George et al. )
Les polykétides (pas immunogénes) = métabolites secondaires produits par un certain nombre de bactéries du sol appartenant à l’ordre des actinomycètes PM de743 daltons ID mycolactone purifiée chez le cobaye => histopathologie = UB Homme (Nécrose, peu PN, Microhémorragies) Variants : Pas production mycolactone, Pas virulent pour cobaye semble agir à la fois comme un immunosuppresseur + cytostatique Gêne de synthèse de la toxine MU : Plasmide

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60 Physiopathologie (2) Nécrose sous-cutanée : due à une exotoxine sécrétée par le germe, responsable de thrombose vasculaire et de l’infarcissement tissulaire.  Ce qui expliquerait la chute importante des tissus adipeux sous-cutanés que l’on observe particulièrement dans les points déclives des membres. Décollement des bords de l’ulcère s’explique par la nécrose du tissu adipeux hypodermique et la thrombose capillaire. Cloisonnement de M. ulcerans dans la zone nécrosée expliquerait l’inaccessibilité du germe par les traitements par voie générale. Facteurs déterminant l’extension de la lésion ? Accumulation (et/ou l’induction) de la toxine lyse du macrophage hôte et pour paralyser les fonctions cellulaires des lymphocytes et des macrophages qui s'infiltrent immunosuppression locale : retarde la réponse immunitaire systémique

61 Conclusion Acido alcoolo résistance Vitesse de croissance
Diversité des espèces Augmentation des espèces opportunistes Emergence de certaines espèces Difficultés d’identification des M atypiques Nécessité d’utilisation outils moléculaires pour l’identification, la tracabilité, étude épidémiologie moléculaire Problèmes dans les PED: Formation, Disponibilité des nouveaux outils d’identification et de diagnostic

62 Merci de votre aimable attention