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Anaïs Brassier Interne de pédiatrie Paris Master 2 de génétique Hôpital Necker Enfants Malades Inserm Unité 781 Y. De Keyzer; P.de Lonlay; A.Munnich.

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1 Anaïs Brassier Interne de pédiatrie Paris Master 2 de génétique Hôpital Necker Enfants Malades Inserm Unité 781 Y. De Keyzer; P.de Lonlay; A.Munnich

2 Maladie rare dintoxication endogène Maladie du catabolisme des acides aminés ramifiés de transmission autosomique récessive Liée à un déficit enzymatique en propionyl CoA carboxylase (PCC) Bloc enzymatique sur la voie de dégradation de 4 acides aminés essentiels (valine, isoleucine, méthionine, thréonine)

3 La PCC convertit le propionyl CoA en méthylmalonyl CoA puis transformation en succinyl CoA qui rejoint le cycle de Krebs (CK) Principal but du CK: synthèse de NADH utilisé par la chaîne respiratoire mitochondriale (CR) Cycle de Krebs

4 Forme typique (déficit enzymatique complet): révélation néonatale par un coma progressif avec acido- cétose et hyperammoniémie Décès rapide en labsence de traitement Formes plus tardives (déficit enzymatique partiel): présentations neurodigestives très variables Formes rares dAP sensibles à la biotine (B8: cofacteur de la PCC)

5 Non spécifiques: Acidose métabolique à TA augmenté Cétose Hyperlactacidémie Hyperammoniémie Spécifiques: CAO urinaire: accumulation de métabolites toxiques en amont du déficit (3 OH propionate, tiglyglycine, méthylcitrate, et propionylglycine) Diagnostic de certitude = diagnostic moléculaire: recherche du déficit enzymatique par séquençage de lADN (sur sang ou fibroblastes)

6 Complications viscérales à long terme fréquentes et graves: Myocardiopathies Insuffisance rénale Pancréatite Complications neurologiques: nécrose aigüe des noyaux gris centraux (Sd de Leigh); syndrome cérebelleux; régression psychomotrice, mouvements anormaux et convulsions

7 Pronostic à long terme difficile et incertain: morbidité et mortalité élevées Rôle toxique connu du propionyl CoA sur certaines enzymes mitochondriales Complications neurologiques tardives survenant même en cas de contrôle des précurseurs du propionate (régime hypoprotidique suivi limitant lapport des précurseurs de lacide propionique) autre mécanisme physiopathologique…

8 mécanismes mal élucidés, mais probablement liés à un dysfonctionnement énergétique mitochondrial: Une accumulation de métabolites toxiques en amont du bloc enzymatique Un déficit en succinyl CoA en aval du bloc enzymatique Cycle de Krebs

9 Le succinyl CoA est un substrat anaplérotique important du CK, impliqué directement dans la synthèse de NADH Donc: en cas de déficit en succinyl CoA Dysfonctionnement du CK Et déficit secondaire de la CR mitochondriale Hypothèse: augmenter les réserves de substrats anaplérotiques pour restaurer en partie lacitivité du CK et le fonctionnement de la CR afin de prévenir les complications tardives de lAP

10 Étudier lefficacité de traitements anaplérotiques in vitro en contournant la voie du propionate pour restaurer lactivité de la CR Création dun modèle de cellules hépatocytaires humaines (HepG2) rendues déficientes en PCCA (pas de lignées dhépatocytes de patients atteints dAP et le plus souvent les fibroblastes nexpriment pas le déficit enzymatique) par lexpression de RNAi spécifiques du gène

11 synthèse de 4 RNAi ciblant plusieurs régions spécifiques des ARN m de la PCCA (logiciel internet) replacés dans oligonudléotide de 97nt (comportant les motifs de la structure miRNA ) : miPCCA-F (22)miPCCA-R (22) Hairpin micro RNA Pied 5 micro RNAPied 3 micro RNA 97 nt miPCCA-F (22)miPCCA-R (22) Hairpin micro RNA Pied 5 micro RNAPied 3 micro RNA miPCCA-F (22)miPCCA-R (22) Hairpin micro RNA Pied 5 micro RNAPied 3 micro RNA EcoRIXhoI 130 nt Sous clonage des oligonucléotides contenant le RNAi dans un plasmide dexpression EcoR I Xho I + E. coli TMP TMP-miPCCA LigationTransformation amplification par PCR de ces oligonucléotides

12 Promotor = CMV TRE = Tetracycline Responsive Element (Tet- On) Puromycine resistance (promotor pgk) Expression GFP (IRES) Carte du vecteur Transfection des plasmides recombinants dans les cellules hepG2 Sélection des clones HepG2 contenant le plasmide ( par puromycine) avec la plus forte diminution dexpression de PCCA

13 TREpCMV Palindrome du microRNA pPGKpuromycineIRES GFP miPCCA-F (22)miPCCA-R (22) Hairpin micro RNA Pied 5 micro RNAPied 3 micro RNA Micro RNA replié RNAi Hybridation ARNm => inactivation Traitement des clones par doxycycline (0,1 à & µg/ml pendant 15 jours): induction de lexpression des miRNA spécifiques de la PCCA ( système TETon) Inhibition de la PCCA:

14 Caractérisation des clones au niveau protéique: analyse de la PPCA par Western Blot et par dosage de lactivité enzymatique (carboxylation du propionyl CoA avec du C 14 et mesure du méthylmalonyl CoA C 14 produit) Mesure de lactivité de la CR mitochondriale par des techniques de spectrophotométrie Traitements des clones avec la plus forte diminution dexpression de la PCCA, par des substrats anaplérotiques (citrate, aspartate…) pendant 48 à 96h Comparaison de lactivité de la CR avant et après les traitements anaplérotiques

15 Sélection de clones stables contenant le plasmide par puromycine Validation du modèle hépatocytaire par 2 clones indépendants montrant une forte inhibition de la PPCA sous traitement par doxycycline associés à une activité enzymatique très faible ( activité résiduelle de 4 %) Puromycine Selection

16 Leonard J 1995, J Inherit Metab Dis 18: Mardach R, et al. 2005, Mol Genet Metab 85: Ostergaard E, et al. 2007, Brain 130: Schwab M, et al. 2006, Biochem J 398: Yano S, et al. 2003, J Inherit Metab Dis 26:481-8 Brusque M, et al. 2002, Neurochem Int 40: Alberio S, et al. 2007, Mitochondrion 7:6-12 Spinazzola A, et al. 2006, Nat Genet 38:570-5 Elpeleg O, et al. 2005, Am J Hum Genet 76: Mochel F, et al. 2005, Mol Genet Metab 84: Roe C, et al. 2002, J Clin Invest 110:259-69

17 citrate cis-aconitate isocitrate -ketoglutarate succincyl CoA succinate fumarate malate oxaloacétate acétyl CoA H2OH2O H2OH2O CO 2 + CO 2 + Coenzyme A + CoA ADP FADH 2 NADH H2OH2O ATP SDH Complexe II pyruvate glucose


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