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De la génomique aux outils de diagnostic rapides : Applications industrielles Etat des travaux du projet BOARD Bacilles thermorésistants: des Outils dAnalyses.

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1 De la génomique aux outils de diagnostic rapides : Applications industrielles Etat des travaux du projet BOARD Bacilles thermorésistants: des Outils dAnalyses au Recensement des Dangers

2 Gen2Bio, le 27 mars ADRIA, centre de transfert technologique Modélisation –Formulation, durée de vie, process –Microbiologie prévisionnelle Qualité & sécurité de laliment au long de sa durée de vie Hygiène de production, maîtrise des flores dintérêt Outils de diagnostic –Détection, identification, traçabilité –Microbiologie, moléculaire

3 Gen2Bio, le 27 mars ADRIA, centre de transfert technologqiue Modélisation –Formulation, durée de vie, process –Microbiologie prévisionnelle Réponse à des attentes : développement de produit, i.e. expertises, outils, transfert Outils de diagnostic –Détection, identification, traçabilité –Microbiologie, moléculaire

4 Gen2Bio, le 27 mars (Re) émergence de bactéries …Bactéries sporulées …Un bref état des lieux! Travaux en cours Perspectives & discussion

5 Gen2Bio, le 27 mars Productions primaires C. perfringens dans les élevages 1 Craven SE et al. 2001, Avian dis 45: Tansuphasiri et al. 2005, Southeast Asia J Trop Med Public Health 36: Van Immerseel F et al. 2004, Avian pathol 33: colonisation du tractus intestinal de volaille, porc -contamination des environnements primaires -augmentation de lantibiorésistance des isolats 2 -augmentation de lincidence dentérite nécrotique chez les volailles suite à larrêt des antibiotiques comme facteurs de croissance 3 les phénomènes de colonisation du tractus intestinal et de synthèse de toxines restent encore mal connus Contamination des viandes…plats cuisinés et restauration collective 3 ! Contamination des viandes…plats cuisinés et restauration collective 3 !

6 Gen2Bio, le 27 mars Productions secondaires Bacillus Hautement Thermorésistant dans le lait UHT (HRS) - Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans 1,2 Lait UHT Homologie des empreintes génétiques Lait cru Hétérogénéité des empreintes génétiques 1 Scheldeman P et al. 2006, J Appl Microbiol 101: Olivier Guillaume-Gentil et al. 2004, Appl. Env. Microbiol 68:

7 Gen2Bio, le 27 mars Productions secondaires Bactéries HRS dans les produits appertisés - Moorella … -… Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans, Paenibacillus Bactéries HRS et acidophiles dans les pectines de fruit - Alicyclobacillus

8 Gen2Bio, le 27 mars Productions secondaires Bacillus psychrotrophes dans les produits pasteurisés, conservés au froid groupe B. cereus émétique - groupe B. cereus émétique : B. weihenstephanensis % entre 1999 et 2005 des produits réfrigérés prêts à lemploi 1 Thorsen L et al. 2006, Appl Environ Microbiol 72: Hoffmaster AR et al, 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 101: à noter : transfert du plasmide de B. anthracis vers B. cereus 2

9 Gen2Bio, le 27 mars Altérations! Adaptation ou sélection par le process ? Etude de prévalence et analyse des dangers Bactéries sporulées, sélectionnées par les process ou adaptées aux process… – ovoproduits – poudre de lait – produits pasteurisés conservés au froid – produits UHT – produits appertisés – …etc

10 Gen2Bio, le 27 mars Prévalence et analyse des dangers Quand la microbiologie fait défaut… – dénombrements des spores après traitement thermique – dénombrement de B. cereus – dénombrement de C. perfringens Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Geobacillus, Morella, Paenibacillus… Biodiversité de genres, despèces et de caractéristiques physiologiques, et donc de génomes!

11 Gen2Bio, le 27 mars (Re) émergence de bactéries …Bactéries sporulées …Un bref état des lieux! BOARD Perspectives & Discussion

12 Gen2Bio, le 27 mars Bacilles thermorésistants: des Outils dAnalyses au Recensement des Dangers Filières impliquées BOARD

13 Gen2Bio, le 27 mars BBA (Bretagne Biotechnologies Alimentaires) animé par le Pôle Agronomique Ouest ADRO Ouest animé par le Pôle Agronomique Ouest Sociétés des produits de la mer et produits appertisés Partenaires Partenaires industriels

14 Gen2Bio, le 27 mars Partenaires industriels PME Centres R&D Partenaires Sylvie Hallier Patrice Chablain Stéphane Bonilla Danièle Sohier Florence Postollec Ivan Leguérinel Florence Baron Michel Gauthier Sophie Jan

15 Gen2Bio, le 27 mars Développement dun outil de diagnostic moléculaire détection & identification identification aliment BOARD : Objectifs meilleure analyse des risques et évaluation des dangers - la détermination de leur prévalence en IAA pour une meilleure analyse des risques et évaluation des dangers permettant, à partir de matrice alimentaire ou ingrédient, - la détection & identification de bactéries sporulées

16 Gen2Bio, le 27 mars Programme R&D Cahier des charges Sélection des genres, espèces cibles Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus, Geobacillus, Moorella, Paenibacillus B. cereus, B. mycoides, B. pumilus, B. subtilis, B. licheniformis, B. thuringiensis, B. sporothermodurans, B. weihenstephanensis, B. laterosporus Seuil de détection > 10/g et résultats à J1 Enrichissement over-night Outil multi-cibles, avec des contraintes de coûts PCR multi-multicilbes plutôt quune biopuce….GeneDisc!

17 Gen2Bio, le 27 mars Objectif détecter une contamination < 10 spores/g Protocole dextraction Protocole damplification Extraction PCR temps réel 25g aliment + diluant Enrichissement 20h, 37°C Extraction Protocole Programme R&D

18 Gen2Bio, le 27 mars Programme R&D GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes – Exploiter et séquencer ! Recherche de séquences cibles dans les bases de données & séquençage complémentaire Valider lidentification de la collection pour les tests de spécificité Valider les conditions denrichissement / Phylogénie Séquences cibles…

19 Gen2Bio, le 27 mars Arbre phylogénétique C. perfringens Brevibacillus laterosporus Paenibacillus B. cereus Alicyclobacillus acidoterrestris Moorella thermoacetica Anoxybacillus flavithermus Geobacillus stearothermophilus B. subtilis B. pumilus B. licheniformis B. circulans B. weihenstephanensis 30°C aérobie 37°C +/- aérobie 37°C ANaérobie 55°C ANaérobie 55°C aérobie Programme R&D

20 Gen2Bio, le 27 mars 25g matrice + 100ml RCM Inoculation aux concentrations désirées 20h à 37°C anae anaerobiose 20h à 55°C an anaerobiose 20h à 55°C aerobiose 20h à 30°C aerobiose Extraction Détection & identification par PCR en temps réel Programme R&D

21 Gen2Bio, le 27 mars Programme R&D GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes – Analyses et alignement des séquences Sélection de sondes oligonucléotidiques Optimisation des mélanges réactionnels

22 Gen2Bio, le 27 mars Deux GeneDisc Bacillus Paenibacillus, Anoxybacillus Geobacillus GeneDisc1: Genres Clostridium Moorella contrôles Programme R&D B. cereus B. mycoides B. pumilus B. subtilis contrôles B. laterosporus Bacillus GeneDisc2: Bacillus spp. B. licheniformis B. thuringiensis B. sporothermodurans B. weihenstephanensis

23 Gen2Bio, le 27 mars Programme R&D Validation de la méthode – Inclusivité et exclusivité – Niveau de détection – Exactitude Matrices artificiellement contaminées Matrices naturellement contaminées : dénombrement des spores et identification par séquençage

24 Gen2Bio, le 27 mars (Re) émergence de bactéries …Bactéries sporulées …Un bref état des lieux! Travaux en cours Perspectives & discussion

25 Gen2Bio, le 27 mars Perspectives & discussion Prévalence des flores sporulées et analyse des dangers Evolution des GeneDisc en fonction de létat des connaissances : description des espèces et acquisition de séquences BOARD : exemple concret de la génomique aux applications industrielles ! …ANR MEMOSPORE

26 Gen2Bio, le 27 mars Horror vacui… Bactéries sporulées : vers une adaptation aux process de production et de conservation ? –« La nature a horreur du vide. Mais dautant quil ne saurait y avoir despace vide en aucun endroit de lunivers, et que les parties de la matière, étant rondes, ne sauraient se rejoindre si étroitement ensemble, quelles ne laissent plusieurs petits intervalles au recoin entre elles : il faut que ces recoins soient remplis de quelques autres parties de cette matière. » Descartes, Principa philosophiae, 1644 Merci pour votre attention!

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